Сифилис – заболевание инфекционной природы, обусловленное спирохетой Treponema pallidum, склонное к прогредиентному хроническому течению, с чёткой периодизацией клинической симптоматики.

Преобладание полового пути передачи над контактным и трансплацентарным ставит это заболевание в ряд венерических (ЗППП, ИППП). Помимо указанных способов передачи инфекции особую роль играет артифициальный путь (от лат. «artificio» - искусственно созданный).

Он характерен для медицинских учреждений, в основном, реализуется в условиях стационара. Инфицирование происходит при гемотрансфузиях, различных хирургических операциях, инвазивных диагностических методах.

Несмотря на карантинизацию донорской крови, проблема выявления сифилиса у доноров на разных стадиях заболевания все ещё актуальна.

Поэтому диагностические мероприятия при сифилисе требуют стандартизации, внедрения новых чувствительных и информативных методов идентификации, а также сведения к минимуму ошибок и неправильной трактовки результатов анализов.

Показать всё

1. Классификация методов лабораторной диагностики

Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.

Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:

1. 1 Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
2. 2 Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
3. 3 Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.

Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.

1.1. Прямые методы

1. 1 Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
2. 2 Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
3. 3 ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
4. 4 ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.

1.2. Непрямые методы

Серологические реакции - это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.

1. 1 Нетрепонемные тесты:
   • Реакция Вассермана (РСК);
   • Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
   • Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
   • Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
   • Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней - VDRL.
2. 2 Трепонемные тесты:
   • Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
   • Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
   • Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
   • Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
   • Иммуноблоттинг.



Рисунок 1 - Алгоритм серодиагностики сифилиса

1.3. Гистоморфологические методы

Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра. Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.

2. Микроскопия Treponema pallidum в тёмном поле

Этот метод основывается на непосредственном обнаружении бледной трепонемы в исследуемом материале с помощью микроскопа и специальных приспособлений (чаще всего отделяемое эрозий и язв, реже спинномозговая жидкость и другие субстраты).

С помощью скарификации, соскоба, сдавливания с эрозий и язвенных дефектов получают экссудат, затем исследуют в микроскоп подготовленный препарат.

Обычно бледные трепонемы выявляют в препарате, полученном из шанкра, из очагов вторичного свежего, вторичного рецидивного сифилиса, а также пунктата лимфоузлов, плаценты.

Основанный на феномене свечения мелких частиц в тёмном поле при попадании луча света (феномен Тиндаля), метод прекрасно позволяет дифференцировать возбудителя сифилиса от других трепонем на основании морфологических отличий и отличий в способах передвижения бактерии.

Для микроскопии используют специальный темнопольный конденсор соответствующего оптического разрешения. Препарат получают способом раздавленной капли (каплю материала наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и закрывают очень тонким покровным).

На покровное стекло капают иммерсионное масло. С помощью поворота тубуса и поворота увеличивающей линзы регулируют нужное освещение.

В тёмном поле микроскопа обнаруживаются клетки крови, эпителиальные клетки и сам возбудитель сифилиса. Бледная трепонема выглядит как спираль, очень тонкая, излучающая серебристый цвет, с плавными движениями.



Рисунок 2 - Темнопольная микроскопия как способ визуализации бледной трепонемы в исследуемом материале. Источник иллюстрации - CDC

Treponema pallidum необходимо отличать от других трепонем, в том числе и Tr. refringens, которая может содержаться в ротоглотке и на слизистой половых органов. Эта бактерия совершает хаотичные движения, имеет широкие и несимметричные, довольно грубые завитки. Кроме того, Treponema pallidum отличают от Tr. Microdentium, Tr. Buccalis и Tr. vincenti.

Визуализация бактерий в тёмном поле иногда дополняется реакцией флюоресценции. Для этого меченые флюоресцирующим красителем противотрепонемные АТ добавляют в нативный материал. При этом образуется комплекс, называемый антиген-антитело (сокращенно АГ-АТ), который и является объектом для исследования с помощью люминесцентного микроскопа.

3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР, разработанная в 1991 году для обнаружения молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) бледной трепонемы, является высокочувствительным и специфичным, позволяет выявить фрагменты ДНК возбудителя.

Базируется данный анализ на копировании коротких участков ДНК бледной спирохеты, который удовлетворяет заданным параметрам и присутствует в образце. Всё это выполняется в искусственных условиях (in vitro). Реакция проводится в приборе - амплификаторе, который обеспечивает периодизацию температурных циклов. Происходит охлаждение с последующим нагреванием пробирок с погрешностью в 0,1˚С.

ДНК-матрицу прогревают в течение 2 минут при температуре 92-98˚С (максимальная температура используется, если полимераза термостабильна). При нагревании цепи ДНК расходятся из-за распада водородных связей между ними. В стадии отжига температуру реакции снижают для связывания праймера с одноцепочечной матрицей.

Отжиг занимает около 30 секунд, в течение этого времени синтезируются сотни нуклеотидов. Вновь синтезируемые молекулы копируются полимеразой, в результате многократно увеличиваются специфические фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. Последующая детекция фрагментов проводится с помощью электрофореза в геле агар.

ПЦР-диагностика сифилиса пока носит экспериментальный характер, но оправдана при выявлении врождённой инфекции, в сложных диагностических случаях или при минимальном содержании бледных трепонем в исследуемом материале.

4. ДНК-гибридизация

ДНК-гибридизация выполняется in vitro и основана на полном или частичном соединении двух одноцепочечных молекул ДНК в одну молекулу. В случае полного соответствия комплементарных фрагментов объединение происходит легко. Если комплементарное соответствие частичное, то объединение цепочек ДНК происходит медленно. На основании времени слияния цепей можно оценить степень комплементарности.

При нагреве ДНК в буферном растворе разрываются водородные связи азотистыми основаниями, являющимися комплементарными, в результате цепочки ДНК расходятся. Далее получают препарат из двух денатурированных дезоксирибонуклеиновых кислот. При охлаждении одноцепочечные участки ренатурируют. Образуется так называемый гибрид ДНК.

Метод позволяет оценить и анализировать скорость отжига, учитывая особенности (сходства и различия) ДНК между видами или внутри вида.

Применение ДНК-зонда заключается в гибридизации меченого фрагмента ДНК со специфичным участком ДНК для идентификации комплементарных последовательностей нуклеотидов. Для метки зонда используется группа ненасыщенных атомов (хромофоры) или радиоактивные изотопы.

ДНК–зонд применяют для гетерогенного и гомогенного детектирования нуклеиновых кислот. Роль зонда заключается в определении участков, на которых произошло слияние мишень-зонд. Детектирование в гомогенной системе имеет преимущество - позволяет отследить гибридизацию молекул ДНК в реальном времени.

Суть метода сводится в денатурации ДНК и ренатурации (воссоединения цепочек ДНК). Процесс ренатурации нуклеиновой кислоты и ДНК-зонда заканчивается образованием «гибрида».

Специфические последовательности нуклеиновых кислот гибридизуются с ДНК–зондом и, таким образом, выявляются и позволяют оценить количество ДНК в исследуемом материале.

5. Заражение лабораторных животных

Высокая чувствительность кроликов к Treponema pallidum (порядка 99,9%) позволяет применять их в диагностике сифилитической инфекции.

Заражение кроликов проводится в научно-исследовательских центрах и является «золотым стандартом» оценки чувствительности других методов.

Вернёмся к трепонемным и нетрепонемным тестам, так как они используются чаще всего. Рассмотрим их преимущества и недостатки, а также ошибки в интерпретации результатов.

6. Нетрепонемные тесты

Это тесты определения антител IgG и IgM к стандартизированному кардиолипиновому антигену. Их существенным недостатком является сравнительно небольшая специфичность.

Низкая стоимость и простота выполнения позволяют отнести эти тесты к отборочным диагностическим, необходимым для установки предварительного диагноза и скрининга среди населения.

Именно нетрепонемные тесты сдаются при оформлении медицинской книжки, устройстве на работу, постановке на учет в женской консультации.

Недостатки:

1. 1 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса первичного – 70%;
2. 2 Минимальная чувствительность в стадии сифилиса позднего – 30%;
3. 3 Возможность появления ложноотрицательных и ложноположительных результатов;
4. 4 Трудоёмкость выполнения РСК.

Преимущества:

1. 1 Относительно маленькая стоимость производства тестов;
2. 2 Получение быстрого ответа;
3. 3 Возможность их применения для скрининга.

Получение ложноположительных или слабоположительных проб возможно в следующих случаях:

1. 1 Нарушение технологии выполнения, при блокировании комплекса АГ-АТ.
2. 2 Наличие у больного аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артирит, ревматизм, склеродермия, системная красная волчанка, саркоидоз и др.).
3. 3 Злокачественные новообразования.
4. 4 Вирусные и бактериальные инфекции.
5. 5 Эндокринные заболевания (аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет).
6. 6 Беременность.
7. 7 Употребление алкоголя.
8. 8 Приём жирной пищи.
9. 9 Старческий возраст.

Как видно из списка, существует достаточно причин для неверного результата. Поэтому к нему следует весьма настороженно относиться. Рассмотрим наряду с РСК ещё две пробы. Это реакция микропреципитации и VDLR (ее модификация).

7. Реакция связывания комплемента (РСК, Вассермана, RW)

Это проба, основанная на способности комплемента связываться с комплексами АГ-АТ. Идентифицируют образовавшийся комплекс с помощью гемолитической системы. Кардиолипиновый антиген заметно повышает чувствительность пробы.

Чувствительной является и реакция Колмера, которая заключается в выполнении при различных температурных режимах. Так, первая фаза реакции Колмера протекает при температуре 20˚С в течение получаса, вторая фаза при тепературе 4-8˚С на протяжении 20-ти часов. За это время происходит связывание комплемента.

При выполнении РСК возможно получение резко положительных результатов. Причиной, вероятно, является большой титр антител в неразведенной сыворотке. В этом случае пробы ставят с уменьшающими дозами.

Для дифференцировки стадий сифилиса и оценки эффективности противосифилитического лечения определяют количество АТ в сыворотке.

Позитивность пробы оценивают с помощью крестов, также в реакциях Вассермана, Колмера и Канна указывается разведение сыворотки.

8. Реакция микропреципитации

Так как трудоёмкость выполнения вышеуказанных проб велика, то для широты обхвата диспансеризацией разных групп населения разработан ускоренный способ серодиагностики сифилиса, так называемый экспресс-метод – реакция микропреципитации (сокращенно МР, РМП).

Она выполняется с кардиолипиновым антигеном и вспомогательными веществами. Его преимуществом является забор периферической крови для исследования. Это значительно ускоряет и саму методику, и работу лаборантов.



Рисунок 2 - Реакция микропреципитации (схема)

Для проведения МР необходимы плазма или инактивированная сыворотка крови пациента (именно они содержат антитела). Далее плазму помещают в маркированные лунки. Затем, к исследуемому материалу добавляют каплю кардиолипинового антигена, смешивают и встряхивают. В итоге в сыворотке инфицированного появляются характерные хлопья, разные по степени интенсивности.

Это качественная проба. При количественной оценке используются 10 разведений сыворотки, помещаемой в 10 лунок с соответствующей маркировкой. При качественной МР ответ указывается в виде крестов (плюсов) или минуса, при количественной указывается титр антител (1:2, 1:4 и так далее).

Наличие хлопьев расценивается как положительный или слабоположительный ответ. Возможно появление флокулята и при отсутствии заболевания, поэтому окончательную оценку полученного результата проводят после контрольного исследования или проведения других реакций (РИБТ, РИФ, ИФА, РПГА).

9. VDRL

Рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения метод постановки реакции с антигеном липоидной природы (АГ) по праву считается лучшим среди других стандартных нетрепонемных тестов. Разработан в США, штате Джорджиа в лаборатории венерических болезней (Veneral Diseases Research Laboratories).

Аббревиатура учреждения послужила названием для пробы – VDRL. VDRL - это модификация МР. Сыворотку от больного сифилисом инактивируют и помещают на предметное стекло. Используемый антиген состоит из кардиолипина, холестерина и лецитина в разном процентном соотношении. Ответ регистрируется практически сразу.

Отчётливая флокуляция возникает в присутствии в сыворотке антител. Сыворотка становится реактивна по прошествии 4-х недель после заражения. Для оценки количества антител, сыворотку предварительно разводят в геометрической прогрессии.

Преимущества VDRL:

1. 1 сравнительно высокая чувствительность;
2. 2 сравнительно высокая специфичность;
3. 3 легкость выполнения;
4. 4 малая стоимость реактивов;
5. 5 получение быстрого ответа.

Недостатком VDRL является относительно высокая частота ложноположительных результатов.

Их причинами являются всё те же перечисленные выше заболевания.

Трепонемные тесты исполняются со специфическими АГ Treponema pallidum. Они необходимы и обязательны для установления окончательного диагноза. Это реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакции непрямой гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА) и др.

После положительного результата нетрепонемного теста (RPR, MP, VDRL) всегда должны выполняться трепонемные (чаще комбинация - РПГА, ИФА, РИФ).

Трепонемные тесты более сложны в исполнении, чем экспресс-тесты, и требуют больших затрат денежных средств.

10. РИФ

Данная реакция (сокращенно РИФ) используется для диагностики сифилиса, в том числе и скрытых форм, и перепроверки положительных и ложноположительных проб.

РИФ основана на свечении меченых антител при соединении с комплексом антиген-антитело под кварцевой лампой. Метод начал применяться в 60-х годах и отличался простотой выполнения и высокой специфичностью (которая немного уступает РИБТ).

Он имеет несколько модификаций: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-abs.

Наиболее чувствительна РИФ в разведении 10 раз, а остальные - более специфичны. РИФ проводится в двух фазах. К АГ добавляют сыворотку крови пациента. Образуется комплекс АГ-АТ, который исследуется в следующей фазе. Далее меченный с помощью флюоохрома комплекс идентифицируют при микроскопии. Если не наблюдается свечение, это указывает на отсутствие специфических АТ в сыворотке крови.

РИФ-200 является наиболее ценным из всех разведений. Метод предназначен для диагностики различных форм сифилиса, особенно скрытого сифилиса и перепроверки положительных проб.

11. РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (сокращено РИБТ, РИТ) одна из сложных серологических проб, требующих значительных усилий и финансовых затрат. РИБТ применяют все реже, но актуальность ее сохраняется в диагностике скрытого сифилиса.

Большое значение она несёт в распознавании ложноположительных результатов у беременных женщин и основывается на иммобилизации бактерий в присутствии иммобилизинов – поздних антител.

Результат оценивается на процентном количестве (%) иммобилизированных трепонем с помощью специальной таблицы:

1. 1 От 0 до 20 - отрицательная проба.
2. 2 От 21 до 50 - слабоположительная проба.
3. 3 От 50 до 100 - положительная реакция.

Ложноположительные результаты также возможны при применении РИБТ. Так, неверный ответ возможен при инфицировании тропическими трепанематозами, а также, при туберкулёзе, циррозе печени, саркоидозе и пациентов старческого возраста.

12. РПГА

Этот анализ крови на сифилис называется реакцией пассивной гемагглютинации (сокращенно, кровь на РПГА, ТРПГА).

Антиген для РПГА приготавливают из эритроцитов барана, покрытых фрагментами бледных трепонем (полученных от инфицированных кроликов (см. рисунок 4)). Для анализа используется венозная кровь (плазма или инактивированная сыворотка) пациента.

При добавлении антигена в сыворотку пациента с сифилисом происходит образование комплекса АГ-АТ, который приводит к агглютинации эритроцитов. агглютинация определяется субъективно врачом-лаборантом.



Рисунок 3 - Схема РПГА (реакция пассивной гемагглютинации)

Проба оценивается как положительная при появлении агглютинатов равномерной розовой окраски. Окрашивание преципитата в красный свидетельствует об осаждении эритроцитов. РПГА является высокочувствительной и высокоспецифичной.

12.1. Реакция микрогемагглютинации

Она является упрощённым вариантом РПГА. Отличается от пробы, описанной выше, меньшим количеством антигена, разбавителя и сыворотки крови для выполнения реакции. Через 4 часа после инкубации сыворотки можно оценить пробу. Используется при скрининговых и массовых обследованиях на сифилис.

13. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращенно ИФА) базируется на специфической реакции антиген-антитело. Биологический материал (сыворотка крови пациента, ликвор) вносят в лунки, на твердой поверхности которых фиксированы антигены бледной трепонемы. Исследуемый материал инкубируют, затем отмывают антитела, не связавшиеся с антигенами (см. рисунок 5).

Идентификация полученного комплекса осуществляется на этапе ферментации с помощью иммунной сыворотки, меченной ферментом. При химической реакции фермент окрашивает полученные комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от количества специфических антител в крови пациента и фиксируется спектрофотометром.



Рисунок 4 - Схема ИФА (иммуноферментного анализа)

Чувствительность ИФА составляет более 95% . Метод используется в автоматизированном режиме для исследования декретируемых групп населения: доноров, беременных и других, для уточнения диагноза при положительных и ложноположительных нетрепонемных тестах.

14. Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг – высокочувствительный метод, модификация простого ИФА. Реакция основана на электрофорезе с разделением антигенов бледных трепонем.

Разделенные иммунодетерминанты переносят на нитроцеллюлозную бумагу и проявляют в ИФА. Далее инкубируют сыворотку и смывают не связавшиеся антитела. Полученный материал обрабатывают иммуноглобулинами (IgМ или IgG), меченными ферментом.

15. Клиническая оценка результатов лабораторной диагностики сифилиса

В таблице 1 ниже мы привели возможные результаты анализов и их расшифровку. Как можно видеть в таблице, основное значение при расшифровке имеет комплексная оценка тестов.



Таблица 1 - Расшифровка результатов серологических реакций (анализов крови на сифилис). Для просмотра кликните по таблице

Оценка реактивности тестов выполняется также «крестами»:

1. 1 Максимальный ответ (резко положительная проба) обозначается с помощью 4-х крестов.
2. 2 Положительная проба обозначается с помощью 3-х крестов.
3. 3 Слабоположительную реакцию обозначают двумя крестами.
4. 4 Один крест свидетельствует о сомнительном и отрицательном результате.
5. 5 Отрицательный ответ маркируют знаком «минус».

Проблема оптимизации лабораторной диагностики сифилиса не потеряла свою актуальность до настоящего времени. Современные методы диагностики, несмотря на стремление учёных привести диагностику к максимально высоким показателям чувствительности и специфичности, требуют контрольной проверки и индивидуального подхода.

Особенностью сифилитической инфекции является феномен серорезистентности, который так и не получил научного объяснения. Диагноз выставляется после полноценного обследования больного эпидемиологическими, клиническими, лабораторными методами.

На фоне экономико-технического развития медицины наблюдается и прогресс в разработке новых критериев диагностики сифилиса. Всё это позволит быстро, успешно и безошибочно лечить пациентов.

Трепонемные тесты на сифилис. Общее описание.

Чтобы достоверно диагностировать сифилис и выявить противосифилитические антитела в организме больного (в сыворотке крови или спинномозговой жидкости), используют особые технологии лабораторных исследований - так называемые серологические методы .

При проведении диагностических тестов на сифилис, применяются различные серологические реакции : агглютинации, преципитации, иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др. В основе всех этих серологических реакций лежит взаимодействие антигенов и антител .

Специфические серологические тесты называются трепонемными потому, что в этих тестах используются бледные трепонемы или их антигены, то есть антигены трепонемного происхождения. Цель трепонемных тестов - выявление специфических антител к антигенным структурам возбудителя сифилиса, то есть антител, направленные конкретно против самих бактерий T. Pallidum, а не против тканей организма, поврежденных трепонемой. Специфические противотрепонемные антитела класса IgM могут быть обнаружены уже в конце второй недели заболевания.

7. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Положительные результаты РВ на сифилис у лиц, не страдающих этим заболеванием, называют ложноположительными. Частота ложноположительных результатов у здоровых лиц составляет 0,2-0,25 %. Если процент неспецифических ложноположительных результатов РВ у здоровых очень мал, то при некоторых заболеваниях он может быть высоким.

Все неспецифические результаты серологических реакций можно разделить на следующие основные группы:

1. Заболевания, обусловленные наличием общих антигенов у сходных возбудителей (спирохет): возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, трепонема полости рта, лептоспиры.

2. Положительные реакции, обусловленные изменением липидного обмена и изменением в глобулинах сыворотки. К ним относятся положительные результаты у беременных, больных подагрой, нарушения липидного состава в результате отравления свинцом, фосфором, после приема натрия салицилата, дигиталиса и др. В число этих реакций следует включить и положительные реакции при некоторых инфекционных заболеваниях (сыпной тиф, малярия, пневмония, лепра, эндокардит, коллагенозы, инфаркт миокарда, сотрясение мозга, онкологические заболевания, цирроз печени и др.)

3. Технические ошибки проведения. Неправильный выбор дозы комплемента, несоблюдение условий и сроков хранения реагентов, исключение из постановки реакции контрольных образцов сывороток крови, использование загрязненных пробирок и инструментов.

8. Модификация реакции Вассермана

Имеются модификации постановки реакции Вассермана в качественном и количественном вариантах, на холоде, со спинномозговой жидкостью.

Модификация РВ на холоде оказалась более чувствительной. Особенностью методики постановки реакции Вассермана на холоде является трехфазность температурных режимов, при которых протекает связывание комплемента. Эта реакция также ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном.

Кроме качественной оценки РВ, имеется метод ее количественной постановки с различными разведениями сыворотки крови (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный результат (4+). Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за эффективностью терапии.

9. Область применения

В России РСКт входит в состав комплекса стандартных серологических реакций на сифилис (КСР).

Реакцию Вассермана с трепонемным и кардиолипиновым антигеном (РСКт) применяют для

• диагностики всех форм сифилиса,
• контроля за эффективностью лечения,
• обследования лиц, имевших половой контакт с больным сифилисом,
• обследования лиц с клиническим и анамнестическим подозрением на сифилис
• при профилактическом обследовании на сифилис больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, в том числе лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.

В настоящее время, приказом Министерства Здравоохранения РФ, рекомендовано заменить РСКт на более чувствительные трепонемные методы (ИФА или РПГА).

За рубежом реакция Вассермана с трепонемальным антигеном уже давно не применяется в клинической лабораторной практике и не входит в список стандартных тестов, рекомендованных Всемирной Организацией Здравоохранения.

Комплекс классических серологических реакций (КСР)

КСР - это комплекс реакций , применяемых для серодиагностики сифилиса в качестве стандартного метода. Этот комплекс реакций включает в себя реакцию Вассермана с кардиолипиновым антигеном (экстракт из сердца быка, обогащенный лецитином и холестерином) и трепонемным антигеном (обработанная ультразвуком взвесь апатогенных культуральных бледных трепонем), а также микрореакцию преципитации (РМП) с плазмой или инактивированной сывороткой, которая ставится с кардиолипиновым антигеном

КСР становятся положительными в середине первичного периода (его деление на серонегативный и серопозитивный как раз и определяется по КСР), во вторичном периоде КСР положительны у 98-100% больных, а при третичном – лишь у 60- 70%. То есть, по мере увеличения давности заболевания позитивность КСР постепенно снижается.

Достоинства КСР:

1) Дешевизна, простота и быстрота постановки. Особенно это характерно для реакции микропреципитации: РМП в настоящее время – главный скрининговый (отборочный) метод;

2) Нетрепонемные тесты удобно использовать для контроля излеченности сифилиса.

Недостатки КСР:

1) Субъективность оценки результатов реакций («на глаз»);

2) Малая чувствительность при поздних формах сифилиса;

3) Недостаточная специфичность по сравнению с более современными тестами. При их проведении часто отмечаются ложноположительные реакции (ЛПР).

ЛПР могут быть обусловлены перекрестной реактивностью между бледной спирохетой и другими микробами, нарушениями липидного и белкового обмена, нестабильностью клеточных мембран, образованием аутоантител. ЛПР отмечаются при острых (малярия, инфекционный мононуклеоз и др.) и хронических (туберкулез, лепра, гепатит, боррелиоз и др.) инфекциях, инфаркте миокарда, циррозе печени, коллагенозах (особенно – при СКВ), онкопатологии, вакцинации, употреблении наркотиков, злоупотреблении алкоголем и жирной пищей. Ложноположительными могут быть КСР в последние недели беременности, после родов, а у некоторых женщин и во время месячных. Ложноотрицательные результаты КСР могут быть связаны с ВИЧ-инфекцией.

РИТ, РИБТ - Реакция иммобилизации бледных трепонем

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ; Treponema pallidum immobilization test, TPI) - классический метод, который служит для выявления специфических трепонемных антител. Реакция РИБТ использует в качестве антигена патогенные бледные трепонемы T. pallidum (штамм Nichols), выращенные в яичке кролика. РИБТ основывается на потере подвижности живых бледных трепонем после воздействия антител из сыворотки крови пациента и комплемента. Результаты оцениваются посредством темнопольной микроскопии. Несмотря на то, что тест РИБТ был введен в клиническую практику в качестве специфического теста на сифилис, он является трудоемким, технически сложным, времязатратным и дорогим в применении.

1. История метода РИБТ

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) является фактически первым специфическим тестом для диагностики сифилиса. Эта реакция была представлена в 1949 году американскими исследователями Нельсоном и Майером (R. W. Nelson и M. M. Mayer) и подробно рассмотрена в научных работах в последующие десятилетия. Безуспешные попытки использовать живые трепонемы в тестах предпринимались и раньше. Благодаря тому, что Нельсону удалось создать среду, в которой трепонемы сохраняли жизнеспособность до 8 дней, его исследования увенчались успехом.

2. Принцип метода РИБТ

Метод основан на феномене потери бледными трепонемами подвижности в присутствии иммобилизирующих противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и комплемента в анаэробных условиях. Антигеном служат живые патогенные бледные трепонемы, полученные от искуственно зараженных сифилисом кроликов.

3. Постановка теста РИБТ

В реакции участвуют испытуемая сыворотка, комплемент и антиген. К живым трепонемам, полученным из тканей яичка кролика после искусственного заражения, добавляют сыворотку крови исследуемого. При наличии в сыворотке противотрепонемных антител-иммобилизинов, бледные трепонемы прекращают движение (иммобилизируются). Антитела-иммобилизины относятся к поздним антитрепонемным антителам.

Реакция ставится с инактивированными прогреванием сыворотками или с образцами сывороток, высушенных на вощеной бумаге (сухие капли). Инактивацию сыворотки прогреванием проводят 30 минут при температуре 56°С. Перед взятием крови обследуемый не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на срок их возможной задержки в организме.

В качестве антигена используются бактерии штамма Никольса, полученные из 7–10-дневного кроличьего сифилитического орхита (воспаления яичка). Период от момента постановки реакции до регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей подвижности микроорганизмов необходима среда выживания.

В РИБТ применяют комплемент морских свинок. Для получения комплемента кровь берут обязательно в условиях стерильности у нескольких морских свинок.

В случае бактериального загрязнения комплемент бракуют. Нельзя применять в реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для микроорганизмов.

В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. Количество его в значительной степени зависит от среды выживания для бледных трепонем.

РИБТ ставят в стерильных боксах, предварительно облученных бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут. Каждую сыворотку крови исследуют в двух пробирках: опытной и контрольной . В обе пробирки вносят исследуемую сыворотку и антиген в необходимых количествах. В опытную пробирку наливают активный комплемент, а в контрольную такое же количество инактивированной сыворотки крови морской свинки. После заполнения содержимое пробирок перемешивают легким встряхиванием.

РИБТ протекает в анаэробных условиях. Пробирки с ингредиентами помещают в микроанаэростат, из которого вакуумным насосом отсасывается атмосферный воздух и нагнетается газовая смесь из баллона (95 частей азота и 5 частей углекислого газа). Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат (35°С) на 18-20 часов.

Оценку результатов РИБТ производят после извлечения пробирок из термостата и микроанаэростата (т.е. через 18-20 часов опыта). Пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю содержимого пробирки, которую накрывают покровным стеклом и исследуют в темном поле микроскопа (объектив 40, окуляр 10X). Просматривают несколько полей зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и отрицательной сыворотками крови, с активным и инактивированным комплементом и средой выживания для бледных трепонем. Контрольную отрицательную сыворотку крови применяют для суждения о степени подвижности бледных трепонем в данном опыте. Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в условиях данного опыта. Исследование активного и инактивированного комплемента и среды проводят для определения их влияния на подвижность бледных трепонем.

При недостатке комплемента в опыте, иммобилизирующие антитела не проявляют свою активность должным образом и трепонемы остаются подвижными. Поэтому, после опыта проводят определение остаточного комплемента, чтобы оценить, не была ли подвижность бледных трепонем в опытных пробирках обусловлена отсутствием комплемента. Для этого применяется гемолитическая система - выдержанная в термостате смесь из взвеси эритроцитов барана и разведённой гемолитической сыворотки.

Остаточный комплемент определяют добавлением в каждую пробирку гемолитической системы в нужном объеме. Пробирки помещают в термостат при 37° на 45 минут. В опытных пробирках должен наступить гемолиз эритроцитов, в контрольных должна быть задержка гемолиза. Отсутствие в опытных пробирках гемолиза указывает на недостаточное количество комплемента, в этих случаях исследование надо повторить. Повторное исследование сыворотки крови не производят только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

4. Учет результатов РИБТ

Подсчет утративших подвижность, иммобилизованных трепонем ведется под микроскопом, методом темнопольной микроскопии. От исследователя требуется навык оценки движения трепонем. Ему следует обращать внимание на интенсивность движений, совершаемых бледной трепонемой. У этой бактерии не всегда можно наблюдать волнообразные сокращения и сгибательные движения, иногда только вращательные. Следует также уметь отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Для оценки результатов реакции рассчитывается процент иммобилизации бледных трепонем, т. е. соотношение подвижных и неподвижных трепонем в опыте (с активным комплементом) и контроле (с неактивным комплементом) по формуле:

X = (М – С)×100/М

где М - количество подвижных трепонем в контроле; С - количество подвижных трепонем в опыте; X - % иммобилизации. В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице с применением вышеуказанной формулы.

Реакция иммобилизации бледных трепонем оценивается как

• положительная при иммобилизации 51 - 100% трепонем,
• слабоположительная: 31 - 50% неподвижных трепонем,
• сомнительная: 21 - 30% неподвижных трепонем,
• отрицательная: 0 - 20% неподвижных трепонем.

Реакция иммобилизации бледных трепонем становится положительной в конце первичного – начале вторичного периода сифилиса (с 7-8-й недели от момента заражения и более). Вместе с тем РИБТ малопригодна для диагностики ранних стадий сифилиса, поскольку антитела, иммобилизирующие бледные трепонемы и определяемые в реакции, появляются только через 3-6 недель после заражения. Антитела-иммобилизины относятся к классу иммуноглобулинов IgG. Они появляются в крови позже реагинов (антикардиолипиновых антител), позже антител-флюоресцинов (выявляются РИФ и ИФА) и преципитинов (выявляются РМП).

В дальнейшем РИБТ остается положительной. Отмечается высокая чувствительность реакции при поздних формах сифилиса. При вторичном, позднем сифилисе, нейросифилисе, врожденном сифилисе положительный результат РИБТ регистрируется в 95–100 % случаев. При третичном сифилисе, при специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, когда РВ часто отрицательная, РИБТ дает положительные результаты в 98 - 100% случаев.

РИБТ долгое время признавалась самым специфичным тестом на сифилис. По данным литературы, специфичность РИБТ равна 99 %, чувствительность колеблется от 79 до 94 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИБТ (суммарно, по всем стадиям сифилиса) составляет 87,7%.

7. Область применения метода

Сфера применения РИБТ постепенно сужается из-за длительности постановки, дороговизны и трудоемкости. РИБТ - это достаточно сложный и затратный анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария. В связи с этим применение данного метода в последние годы существенно сократилось. В США этот тест в настоящее время применяется только в исследовательских лабораториях.

Исходя из сложности и дороговизны РИФ и РИБТ, имеет смысл применять их для диагностики поздних и скрытых форм сифилиса. РИБТ сохраняет свои позиции как «реакция-арбитр» при дифференциальной диагностике ранних скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов. Эта реакция может быть полезн при диагностике нейросифилиса и при расхождении результатов других серологических тестов.

РИБТ становится положительной значительно позже, чем РИФ и РВ. Поэтому для диагностики заразных форм сифилиса она не применяется.

РИБТ, как и РИФ, очень медленно негативируется в процессе противосифилитической терапии. Вследствие этого она непригодна для контроля за ходом противосифилитической терапии.

Ложноположительные результаты (ЛПР) при РИБТ редки и отмечены главным образом при ряде трепонематозов (фрамбезия, пинта, беджель), не встречающихся в России, а также при лепре, саркоидозе, СКВ, туберкулезе, циррозе печени и некоторых других редких заболеваниях несифилитической природы. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.

РИБТ может оказаться ложноположительной, если в исследуемой сыворотке содержатся трепонемоцидные вещества (например, пенициллины, тетрациклины, эритромицин), вызывающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем, Это может быть следствием приема трепонемоцидных антибиотиков пациентом, поэтому обследование не проводят лицам, получавшим антибиотики в течение последнего месяца. Кровь на РИБТ можно исследовать не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других противосифилитических препаратов.

9. Модификации реакции иммобилизации бледных трепонем

Помимо микроанаэростатной методики существует меланжерная постановка РИБТ по Н.М. Овчинникову. Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота и углекислого газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

10. Особенности, преимущества и недостатки РИБТ

РИБТ - это технически сложный и дорогостоящий метод диагностики. Технология требует значительных средств для содержания кроликов и проведения тестирования. Этот трудоемкий тест в настоящее время он применяется в основном для научных целей. В большинстве зарубежных стран уже почти 40 лет РИБТ практически используется не для диагностических целей, а только в научно-исследовательской работе.

Недостатки реакции:

• РИБТ требует работы с живыми патогенными бледными трепонемами штамма Никольс, остающегося заразным для человека несмотря на адаптацию для кроликов
• постановка реакции сложна, трудоемка и дорогостояща
• необходимо наличия вивария
• требуется высококвалифицированный персонал для постановки реакции, учета результатов и содержания вивария
• субъективность оценки результатов
• отсутствие автоматизации
• нет возможности стандартизировать этот серологический метод.
• реакция неприменима на фоне проводимой антисифилитической терапии
• невозможность использовать для контроля излеченности. РИБТ у больных сифилисом может оставаться положительной в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение.
• реакция может давать ложноположительные результаты у больных злокачественными опухолями, диабетом, лепрой, аутоиммунными заболеваниями, пневмонией, тяжелой сердечно-сосудистой патологией.

Достоинствами РИБТ являются:

1) Достаточно высокая чувствительность;

2) Высокая специфичность.

РИФ (Реакция иммунофлюоресценции)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - метод экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Тесты, основанные на детекции флюоресцентного сигнала, считаются одними из лучших тестов на сифилис.

1. История метода

Трепонемный флюоресцентный тест - реакция иммунофлюоресценции - РИФ (Fluorescent treponemal antibody, FTA) был впервые разработан в 1957 г. Deacon и соавторами (Deacon, Falcone and Harris).

2. Принцип метода

Метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета

В качестве антигена в РИФ используется взвесь живых патогенных бледных трепонем штамма Никольс из орхита кролика, которая высушивается на предметном стекле и фиксируется ацетоном. К высушенным и фиксированным ацетоном к стеклу бледным трепонемам добавляется сыворотка крови больного.

После промывания препарат обрабатывается сывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулинов человека, меченные флюоресцином. Еще раз промывают препарат и смотрят его под люминесцентным микроскопом. Если в исследуемой сыворотке есть противотрепонемные антитела-флюоресцины, будет отмечаться желто-зеленое свечение трепонем.

3. Способ проведения исследований методом РИФ

Фиксированный на предметном стекле антиген (патогенные бледные трепонемы) обрабатывается испытуемой сывороткой. После промывания препарат обрабатывается люминесцентной сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченной флюорохромом. При этом образующийся флюоресцирующий комплекс (античеловеческий глобулин + флюоресцеин тиоизоционат) связывается с человеческим глобулином на поверхности бледной трепонемы, обеспечивая свечение бледной трепонемы под люминесцентным микроскопом.

Для выявления комплексов антиген-антитело применяют люминесцирующую сыворотку, представляющую конъюгированные с ФИТЦ антивидовые (противочеловеческие) иммуноглобулины. Наличие в сыворотке антител к трепонемам определяют по свечению трепонем при исследовании в люминесцентном микроскопе. Тест проводят в качественном и полуколичественном вариантах.

4. Учет результатов

Визуализация результатов РИФ проводится с помощью люминесцентного микроскопа. Результаты оцениваются по степени свечения трепонем в препарате. При наличии антител видно свечение трепонем, если же в сыворотке не было противотрепонемных антител, то трепонемы не видны. Степень свечения фиксированных к стеклу высушенных бледных трепонем обозначаются в «плюсах» (от «–» до «++++»). Отрицательный результат - отсутствие свечения или уровень фона - 1+.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) достаточно чувствительна на всех стадиях инфекции, с окончания периода инкубации до позднего сифилиса. Первичный период сифилиса при классическом течении начинается через 3-4 недели после заражения. РИФ становится положительной в первые дни первичного периода или даже в конце инкубационного периода, с 3-й недели после инфицирования. Результаты РИФ остаются положительными во всех периодах, в том числе при поздних формах.

РИФ становится положительной несколько раньше, чем РВ. По некоторым данным, положительная РИФ бывает у 80% больных первичным серонегативным сифилисом. Во вторичном периоде РИФ положительная почти в 100% случаев. Она всегда положительная при латентном сифилисе и дает 95 - 100% положительных результатов при поздних формах заболевания и врожденном сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это группа методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. РИФ чувствительна во всех стадиях инфекции, начиная от периода инкубации и заканчивая поздним сифилисом. По данным ВОЗ, чувствительность РИФ при первичном сифилисе – 70-100%, при вторичном и позднем – 96–100%, специфичность – 94–100%. По данным ЦНИКВИ, чувствительность РИФ при всех формах сифилиса составляет 99,1%.

Специфичность РИФ может быть повышена путем предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом - ультраозвученным трепонемным антигеном, связывающим групповые антитела (РИФ-абс).

7. Область применения метода

РИФ применяется:

• как подтверждающая реакция при раннем, скрытом сифилисе
• при установлении ретроспективного диагноза
• для дифференциации скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов исследований на сифилис.
• как подтверждающий тест при нейросифилисе.

РИФ достаточно широко используют в качестве подтверждающего теста, но она не предназначена для рутинного использования или скрининга, поскольку в  техническом отношении трудна для постановки. Для выполнения РИФ необходимо наличие вивария или приобретение взвеси патогенных бледных трепонем, что ограничивает возможности реакции. Однако в последние годы на отечественном рынке начали появляться тест-системы, позволяющие проводить реакцию при отсутствии вивария и собственного лабораторного штамма патогенных бледных трепонем.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

ЛПР при постановке РИФ бывают редко (при коллагенозах, боррелиозе).

РИФ до сих пор считают одним из лучших тестов на сифилис, «золотым стандартом» серодиагностики. РИФ в сравнении с РИБТ более проста в постановке,

Несмотря на высокую диагностическую ценность, широкому внедрению РИФ в повседневную практику препятствуют необходимость использования живой T. pallidum, высокая стоимость и длительность проведения исследования. Постановка реакции трудоемка. Кроме того, оценка результатов РИФ носит субъективный характер.

Достоинствами РИФ и РИБТ являются:

1) Высокая чувствительность (особенно для РИФ);

2) Высокая специфичность (особенно для РИБТ).

Недостатки РИФ и РИБТ:

1) Техническая сложность, дороговизна методов.

2) Субъективность оценки результатов, отсутствие автоматизации;

3) РИФ и РИБТ у больных сифилисом могут оставаться положительными в течении многих лет (и даже – пожизненно), несмотря на полученное полноценное лечение. Поэтому эти реакции невозможно использовать для контроля излеченности.

10. Модификации метода

На практике для серодиагностики сифилиса используется и использовалось несколько модификаций реакции иммунофлюоресценции:

• РИФ-абс – наиболее чувствительный метод серодиагностики сифилиса, становится позитивным раньше других реакций (с 3-ей недели от заражения);
• РИФ-200 (сыворотка пациента при постановке разводится в 200 раз) – высоко специфичный метод серодиагностики сифилиса.
• РИФ-10 (разведение испытуемой сыворотке в 10 раз) - более чувствительный метод, чем РИФ-200.
• РИФ-ц проводят с ликвором.
• РИФ-абс-IgM - выявление ранних противотрепонемных антител класса IgM.

1. Наибольшее распространение получила модификация РИФ-абс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией. Перед постановкой реакции сыворотка обследуемого истощается смесью непатогенных трепонем для исключения перекрестных реакций. Групповые антитела удаляются из исследуемой сыворотки с помощью разрушенных ультразвуком культуральных трепонем, что существенно повышает специфичность реакции. Поскольку исследуемая сыворотка используется в разведении 1:5, то РИФ-абс отличается высокой чувствительностью.

Основными показаниями для использования РИФ-абс в клинической практике являются:

• диагностика скрытых и поздних форм сифилиса,
• выявление ложноположительных результатов КСР и РМП, особенно у беременных и соматических больных при подозрении на сифилис,
• для установления ретроспективного диагноза заболевания.

РИФ-абс мало информативна при оценке результатов лечения: у 85 % больных, получивших адекватную противосифилитическую терапию, положительные результаты РИФ сохраняются многие годы.

Эту реакцию называют «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Ее используют для арбитражных случаев, но для достоверного результата необходима свежая концентрированная взвесь T. pallidum штамма Nichols из семидневного орхита у кролика, которую нельзя замораживать.

2. В СССР ставилась в двух модификациях - РИФ-10 и РИФ-200 , т. е. с разведением испытуемой сыворотки в 10 и 200 раз. РИФ-200 - исследуемая сыворотка разводится в 200 раз для уменьшения количества ложноположительных результатов. Это обеспечивает высокую специфичность реакции, но чувствительность ее несколько падает. РИФ-10 более чувствительна, но чаще дает неспецифические положительные результаты, чем РИФ-200, отличающаяся высокой специфичностью. РИФ-10 более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.

Чувствительность РИФ-200 и РИФ-абс оценивается 84–99 %, а специфичность - 97–99 %.

3. РИФ-ц проводят с ликвором. Реакция ставится с использованием цельной спинномозговой жидкости для выявления специфических поражений ЦНС.

4. Реакция РИФ-абс-IgM предложена для выявления ранних противотрепонемных антител класса IgM. Эта реакция может использоваться для диагностики врожденного сифилиса, ранних форм сифилиса и дифференциальной диагностики случаев реинфекции и серорецидива.

Известны 2 модификации этой реакции:

– FTA-ABS-IgM, основанная на использовании во второй фазе реакции конъюгата анти-IgM (меченные флюоресцеином антитела к IgM человека) вместо античеловеческого флюоресцирующего глобулина;

– российский вариант РИФ-абс-IgM, отличающийся тем, что к исследуемой сыворотке крови добавляется сорбент, удаляющий IgG-антитела, а с оставшимися IgM-антителами ставится РИФ-абс.

Основными показаниями к постановке РИФ-абс-IgM являются:

– серодиагностика врожденного сифилиса при отсутствии у ребенка манифестных проявлений врожденного сифилиса на коже и слизистых оболочках;

– дифференциальная диагностика реинфекции и клинико-серологического или серологического рецидива сифилиса, при котором РИФ-абс-IgM будет отрицательной, а РИФ-абс - положительной;

– оценка эффективности терапии раннего приобретенного или врожденного сифилиса: после адекватного лечения РИФ-абс-IgM становится отрицательной в течение ближайших 3–6 месяцев.

Эта реакция может использоваться для выявления врожденного сифилиса. Известно, что крупные молекулы IgM не могут проходить через здоровую плаценту. Следовательно, антитела класса М против бледной трепонемы могут появиться в организме ребенка или вследствие нарушения барьерной функции плаценты или же они вырабатываются организмом ребенка, больного сифилисом. Антитела класса IgM появляются в крови больного сифилисом уже в первые недели болезни, а антитела класса IgG появляются позже. Раздельное определение антител обоих классов оказывается исключительно полезным при диагностике врожденного сифилиса у детей, так как наличие у ребенка на первом месяце жизни антител класса IgM будет указывать, что они образованы организмом больного сифилисом ребенка, в то время как выявление только антител IgG будет говорить о материнском происхождении последних.

Постановка реакции 19S(IgM)-РИФ-абс предполагает предварительное разделение c помощью гель-фильтрации более крупных молекул 19S IgM от

фракции более мелких молекул 7S IgG. Дальнейшее исследование в реакции РИФ-абс сыворотки крови, содержащей только фракцию 19S IgM,

устраняет все возможные источники ошибок. Но техника постановки этой реакции сложная и трудоемкая, требует специального оборудования и подготовки специалистов.

Реакция иммунного прилипания (РИП, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Эта реакция основана на использовании феномена, который в 1912 г. описал Rieckenberg. РИП основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса.

Наиболее широко применительно к серодиагностике сифилиса этот тест изучался отечественными и зарубежными авторами в 50-60-е годы. Данные о ценности РИП как диагностического теста были противоречивы. Реакция требовала максимальной точности, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате получались недостоверные результаты.

В России обширные исследования провела Л.В. Сазонова, которая получила близкие результаты в РИП и РИТ при использовании свежеприготовленной взвеси патогенных бледных трепонем штамма Никольса. Однако применение прогретого или консервированного фенолом антигена резко искажало результаты реакции и делало антиген нестабильным. Рекомендовать данный тест для замены РИТ Л.В. Сазонова сочла невозможным.

Г.П. Авдеева, применив при изготовлении антигена другие температурный и временной режимы, получила при изучении РИП иные результаты. По ее данным, чувствительность этой реакции выше чувствительности KCP и РИТ, но несколько уступает РИФ, а специфичность РИП, РИТ и РИФ близка.

Однако отсутствие производственного выпуска антигена для РИП не позволило более широко изучить этот тест и внедрить его в практику.

РПГА-реакция пассивной гемагглютинации

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является распространенным серологическим тестом, прочно укоренившимся в лабораторной практике. обладает достаточно высоким уровнем эффективности при исследовании.

1. История метода РПГА

Впервые о применении РПГА для диагностики сифилиса сообщили G.Blumental и W.Bachman (1932). В 1965 г, для диагностики сифилиса была предложена реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации. О модификации реакции с использованием различных антигенов сообщалось Ratlev Т. в 1965 - 1967 гг. Микромодификацию РПГА предложили Сох Р.М. и соавторы в 1969 году. Первую коммерческую тест-систему разработали японские ученые Tomisava et. al. в 1969 г.

2. Принцип метода РПГА

Из подготовленной однородной взвеси эритроцитов, «нагруженных» антигенами, при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей антитела, выпадает осадок в виде хлопьев. Полученный осадок состоит из эритроцитов, "склеенных" антителами, и называется «гемагглютинат» . Взвесь эритроцитов подготавливается заранее и поставляется в составе диагностических тест-систем.

Процесс склеивания эритроцитов, на поверхности которых присутствуют антигены, называется «гемагглютинация». Склеивание происходит под действием специфических антител (агглютининов). Реакция называется «пассивной» , т.к. собственные антигены эритроцитов не вступают в реакцию, а сами эритроциты выполняют исключительно вспомогательную индикаторную функцию.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации - это разновидность реакции агглютинации, в которой в качестве носителей антигенов используются именно эритроциты (от греч. háima - кровь), а не другие частицы. В общем случае, в реакции агглютинации под действием антител происходит склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток - не обязательно эритроцитов, а, например частиц латекса, бактерий или других антигеннесущих корпускулярных частиц.

При реакции пассивной гемагглютинации для диагностики сифилиса, в качестве антигена используются эритроциты барана или птиц, покрытые антигенами бледных трепонем. При добавлении сыворотки, содержащей специфические антитела, происходит склеивание эритроцитов (агглютинация).

Реакцию РПГА относят к иммунологическим методам, т.к. она основана на специфическом взаимодействии антигена патогенной бледной трепонемы с антителом. В соответствии с «теорие решетки» агглютинация является результатом «сшивки» поверхностных молекул антигена молекулами антител (иммуноглобулинов).

3. Постановка реакции пассивной гемагглютинации

РПГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Процесс соединения антигена с эритроцитами называют сенсибилизацией, а полученный таким образом искусственный корпускулярный антиген - сенсибилизированными эритроцитами. Эритроцитарными диагностикумами называются эритроциты, сенсибилизированные антигеном.

Для приготовления диагностикума применяют обработанные вначале формалином, затем танином эритроциты барана или птиц (чаще куриные), которые подвергают сенсибилизации ультра-озвученным антигеном патогенной бледной трепонемы (штамм Никольса) или рекомбинантными белками бледной трепонемы (TpN15, TpN17, TpN47). Также могут использоваться эритроциты барана, сенсибилизированных ультраозвученным антигеном культуральных бледных трепонем.

Исследуется только сыворотка (не использовать плазму крови) . Не подходят гемолизированные и мутные образцы. Отрицательным контролем служат несенсибилизированные эритроциты (для исключения наличия антиэритроцитарных антител). В каждой серии постановок используют положительный и отрицательный контроль.

В лунки (ячейки) иммунологического планшета вносят образцы исследуемой сыворотки крови и тест-эритроциты. Если в сыворотке крови пациента содержатся специфические противотрепонемные антитела, то при добавлении исследуемой сыворотки в лунку с антигеном происходит образование комплексов "антиген-антитело", связанных с поверхностью носителей (эритроцитов). Визуально это проявляется склеиванием эритроцитов, т. е. гемагглютинацией, которая видна невооруженным глазом. Иммунные комплексы "антитело-антиген-эритроцит", которые под действием сил тяжести постепенно опускаются вниз, распределяются по всей поверхности дна лунки и формируют характерную картину «перевернутого зонтика».

В зависимости от количества антител, содержащихся в исследуемом образце, изображение «перевернутого зонтика» варьируется от максимального, занимающего всю поверхность дна лунки, до небольшого участка в центральной, самой низко расположенной его части (с просветлением в центре и формированием более интенсивного кольца из осевших эритроцитов по периферии).

Иммунные комплексы не образуются, если в образце нет специфических антител или при добавлении в реакцию контрольных (интактных) эритроцитов. При этом, эритроциты постепенно собираются в самой нижней точке дна лунки, формируя фигуру в виде компактного пятна или «пуговки», иногда с незначительным просветлением в центре.

Если сыворотка крови человека содержит антиэритроцитарные антитела, то «зонтик» сформируется в любом случае - как в реакции с тест-эритроцитами, так и с контрольными эритроцитами. В этом случае для выявления специфических антитрепонемных антител рекомендуют применять другие медицинские технологии.

Возможен феномен прозоны (невозможность реакции из-за избытка антител), устраняемый разведением сыворотки.

4. Учет результатов реакции пассивной гемагглютинации

Результаты РПГА учитывают визуально через 60-120 минут при постановке микрометода и через 2–4 ч или на следующий день при постановке макроварианта. При использовании более крупных (ядросодержащих) эритроцитов птиц получают более четкую картину, учет результатов проводят в более ранние сроки.

Возможно определение титра (высокий титр РПГА ≥ 1:2 560).

Результаты исследования оцениваются по 4+ системе (от «–» до «++++») по величине образовавшейся пленочки. При появлении агглютинации эритроциты располагаются на поверхности лунки в виде «зонтика», а при отрицательном результате эритроциты свободно соскальзывают вниз и скапливаются на дне в центре лунки в виде «пуговки».

Общепринятая оценка результатов РПГА:

4+ - положительная РПГА. Агглютинированные эритроциты в виде «зонтика» равномерно выстилают всю поверхность лунки;

3+ - положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их «соскальзывает» к центру. При этом по периферии осадка формируется заметное кольцо;

2+ - слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней части лунки, формируя плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным просветлением в центре;

1+ - неопределенная РПГА, эритроциты образуют рыхлый осадок на дне лунки с нечеткими краями и незначительным просветом в центре;

(–) - отрицательная РПГА, все эритроциты лежат на дне лунки в виде компактного осадка («пуговки» или колечка) на чистом окружающем фоне (без окружающего зернистогоосаждения).

В зарубежной практике результаты РПГА также оценивают как реактивные (в случае образования агглютината), слабореактивные (если образования незначительны) и нереактивные (если не наблюдается агглютинации).

Учет результатов реакции может производиться автоматически с применением специальных анализаторов. Помимо качественного исследования, во всех тест-системах предусмотрен количественный анализ с определением титра.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать РПГА

РПГА становится положительной в середине первичного периода (7-8 недель от момента заражения, через 3–4 недели после появления твердого шанкра) и после лечения годами сохраняется положительной.

При очень высоком уровне антител к трепонеме в исследуемой сыворотке (что наиболее характерно для вторичного сифилиса) возможен ложноотрицательный результат РПГА (так называемый феномен «прозоны»).

Специфические антитела-агглютинины выявляются в крови переболевших сифилисом людей в течение длительного времени, поэтому РПГА не может быть рекомендована для дифференциальной диагностики реинфекции или определения остроты инфекционного процесса.

РПГА не применяется для контроля излеченности, т.к. может оставаться положительной спустя много лет после выздоровления. Вместе с тем ее можно использовать как дополнительный (к РМП или к RPR) метод при контроле эффективности проведенного лечения, исследуя динамику снижения титров антител. Обязательным условием при этом является использование той же РПГА тест-системы, что и при первом (до лечения) обследовании пациента, а также проведение исследования в той же лаборатории.

6. Чувствительность и специфичность РПГА

РПГА считается высокочувствительным и специфичным тестом. Эта реакция является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания. В зависимости от стадии заболевания чувствительность РПГА колеблется. При первичном сифилисе чувствительность РПГА составляет 76% (и выше), при вторичном сифилисе – до 100%. При скрытом раннем - 97 %, при позднем сифилисе - 94 %, со специфичностью 98–100%. Более низкая чувствительность при свежих формах заболевания объясняется более поздним формированием агглютининов.

По данным ГУ «ЦНИКВИ Росздрава» чувствительность РПГА при диагностике различных форм сифилиса составила 99,4%. Большинство исследователей отмечают 98-99% специфичность РПГА.

По чувствительности и специфичности РПГА не уступает, а при поздних формах и врожденном сифилисе даже превосходит РИФ и РИБТ.

7. Область применения метода РПГА

РПГА может применяться в качестве как скринингового, так и подтверждающего теста; может быть использована в полуколичественном варианте с расчетом титра антител. Разработаны количественный метод постановки РПГА, микрометод, а также автоматизированная реакция микрогемагглютинации.

8. Особенности, преимущества и недостатки РПГА

По данным литературы, РПГА стабильно заняла лидирующее место в клинической практике в большинстве стран мира. РПГА –  наиболее  широко  используемый  тест  в  клиниках ИППП за  рубежом. 

Методика РПГА проста в выполнении, не требует специального оборудования: для ее постановки нужен лишь планшет для гемагглютинации. Исследование не занимает длительного времени; реакция высоко чувствительна и специфична. Апробация метода в клинической практике показала, что он является исключительно простым, дешевым и чувствительным. Как и ИФА, РПГА проста в исполнении, не требует высокой квалификации персонала и специального оборудования, возможна ее автоматизация.

Преимущества РПГА-теста:

• простой в постановке и интерпретации, 
• не требует специального оборудования, 
• время получения результата – 45 минут, 
• пригоден для массового скрининга (необходимо всего 25 мкл сыворотки в разведении 1:20), 
• высокая степень стандартизации, 
• наличие внутренних контролей, 
• большой срок годности, 
• приемлемая цена 
• возможность автоматизации учета. 

Следует отметить также недостатки РПГА: 

• возможность неспецифических реакций при наличии антиэритроцитарных антител, 
• отсутствие корреляции титра и стадии сифилиса,
•  более поздняя позитивация реакции на ранних стадиях сифилиса, 
• возможность ложноположительных реакций у лиц, принимавших алкоголь, наркоманов, 
• чувствительность к вибрации и температуре в лаборатории.

Преимуществами РПГА по сравнению с РИБТ и РИФ являются:

• использование промышленных тест-систем,
• возможность автоматизации реакции,
• нет необходимости работать с живой бледной трепонемой,
• отпадает потребность в виварии.

9. Источники и причины ошибок при постановке РПГА, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Реакция пассивной гемагглютинации является относительно несложным исследованием; при ее выполнении необходимо соблюдать все рекомендации производителей диагностикума и правила работы в клинико-диагностической лаборатории. Допущенные ошибки могут приводить к появлению и регистрации как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции. Ложноположительные результаты РПГА могут быть обусловлены влиянием человеческого фактора и факторов биологической природы.

Ложноположительные результаты могут быть получены

• при исследовании сывороток крови пациентов с невенерическими трепонематозами,
• за счет ревматоидного фактора
• за счет перекрестно реагирующих с трепонемным антигеном антител, образующихся при различных системных или индуцированных лекарствами и наркотиками нарушениях обмена,
• из-за аномального уровня иммуноглобулинов;
• у новорожденных детей - за счет образования в организме плода или ребенка IgM-антител к IgG матери, что осложняет трактовку результатов и диагностику врожденного сифилиса.

Ошибки, вызванные влиянием фактора участия человека на исследование:

• загрязненные микропланшеты
• неправильное пипетирование
• наличие вибрации в лаборатории
• температура воздуха в лаборатории выходит за диапазон температуры: 18–25 градусов

К наиболее типичным техническим ошибкам при постановке РПГА, приводящим к получению недостоверных результатов, следует отнести:

• неточное разведение ингредиентов,
• нарушение температурного режима,
• нарушение времени инкубации реагентов,
• нарушение сроков нанесения реагентов на планшет,
• несоответствие рН растворов требуемым,
• загрязнение лабораторной посуды.

Источником ошибок при постановке РПГА могут являться и следующие технические моменты:

• исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови;
• неравномерная концентрация эритроцитов в диагностикуме вследствие недостаточного его перемешивания перед использованием;
• нарушение сроков и условий хранения диагностикума и контрольных эритроцитов; использование наборов с истекшим сроком годности;
• использование при постановке реакций загрязненных пробирок, наконечников пипеточных дозаторов, пипеток, иммунологических планшетов, растворов;
• неточности при первичном разведении образца сыворотки крови;
• недостаточная тщательность выполнения последовательных двукратных разведений;
• несоблюдение температурного режима и времени инкубации;
• наличие посторонних вибраций и встряхиваний иммунологического планшета во время инкубации;
• нарушение методики постановки РПГА, выражающееся в отказе от выполнения исследования с контрольными эритроцитами.

Применение плазмы крови, содержащей антикоагулянты, способные вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитов (РПГА), может привести к получению результатов, не подлежащих трактовке.

Число ложноположительных и ложноотрицательных результатов меньше, чем при других серологических тестах. ЛПР при постановке РПГА бывают редко и возможны при трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта). Также, ложноположительные результаты регистрировались (в сумме менее 1 %) у наркоманов, у больных инфекционным мононуклеозом, боррелиозом, лепрой, при коллагенозах, циррозе печени, лимфосаркоме, а также у беременных.

Ложноотрицательные результаты реакции могут быть обусловлены конкуренцией между IgM- и IgG-антителами. Также ложноотрицательные результаты возможны у ВИЧ-инфицированных пациентов.

10. Модификации метода РПГА

Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов.

Кроме того, разработан автоматический диагностический комплекс анализа изображений, что позволило производить количественную автоматическую оценку результатов и исключить субъективизм в интерпретации полученных данных. Аппаратно-программный комплекс распознает изображение, проводит обработку данных и выдает ответ в относительных единицах. 

Для автоматизации учета результатов РПГА также используются ридеры и автоматические анализаторы.

ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination) - реакция агглютинации искусственных частиц для выявления антител к Treponema pallidum

Краткое описание теста TPPA

В настоящее время для диагностики сифилиса применяют также модификацию метода пассивной гемагглютинации - ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination), в которой антиген бледных трепонем фиксирован на желатиновых частицах. Так как на искусственных полимерных частицах нет собственных антигенов, обусловливающих биологическую активность, то наборы для серодиагностики сифилиса на их основе имеют основания считаться более совершенными. Использование биологически инертных искусственных частиц сводит к минимуму неспецифическую агглютинацию, обычно наблюдаемую при использовании других носителей.

TPPA используется для серологической диагностики антител к различным видам и подвидам патогенных трепонем. Этот тест может использоваться для определения антител к возбудителям сифилиса, пинты, беджеля и фрамбезии.

Процедура исследования весьма проста и не требует специального оборудования - используются стандартные «U»-образные микропланшеты. В основе теста лежит агглютинация желатиновых частиц, сенсибилизированных антигенами T. pallidum, антителами, содержащимися в сыворотке крови пациента.

TPPA - это подтверждающий трепонемный тест, который удобно использовать как для исследования малого числа образцов, так и для массового скрининга. TPPA используется за рубежом в качестве подтверждающего теста и для замены микро-гемагглютинационного теста MHA-TP (microhemagglutination assay for antibodies to T. pallidum).

Чувствительность теста TPPA составляет от 85% до 100%, а специфичность - от 98% до 100%. Чувствительность TPPA для первичного сифилиса - 88%, для вторичного и позднего скрытого сифилиса 98%-100%.

Если TPPA используется для диагностики сифилиса, то антитела к другим видам трепонем (таким, как T. pallidum endemicum, pertenue, или carateum) могут вызвать ложноположительные результаты. Существует ряд методов, позволяющих удалить эти антитела из сывороточных образцов перед началом теста.

Принцип теста TPPA

TPPA - это метод пассивной агглютинации желатиновых частиц в сыворотке или плазме крови человека. Сыворотка, содержащая антитела к патогенной трепонеме, реагирует с желатиновыми частицами, сенсибилизированными антигеном бледных трепонем штамма Никольса, подвергнутых действию ультразвука. В результате реакции, в лунке планшета для микротитрования формируется гладкая пленка агглютинированных желатиновых частиц.

Если антитела отсутствуют, то частицы оседают на дно лунки планшета, формируя компактную «пуговку» из неагглютинированных частиц. Контрольные лунки с несенсибилизированными желатиновыми частицами должны также показать такую компактную «пуговку» для каждой сыворотки, то есть отсутствие агглютинации.

Применение теста TPPA

ТРРА - это тест универсального назначения, который может одинаково успешно применяться как при обязательном профилактическом обследовании групп населения на сифилис (скрининге), так и в специализированных дерматовенерологических учреждениях. Достоинством теста TPPA является его высокая чувствительность, не уступающая классическим тестам, которые до недавнего времени являлись «золотым стандартом» серодиагностики сифилиса. Среди других достоинств теста - высокая воспроизводимость, а также простота и скорость постановки реакции.

Тест TPPA применяется для подтверждения положительных результатов нетрепонемных скрининговых тестов на сифилис, таких, как тест VDRL, а также для обследования пациентов с отрицательными результатаи нетрепонемных тестов, но имеющих признаки или симптомы, указывающие на поздний сифилис. Не рекомендуется использование TPPA в качестве единственного скринингового теста на сифилис.

Кроме того, агглютинационный тест ТРРА может использоваться для исследования образцов спинномозговой жидкости при диагностике нейросифилиса. При этом, как и в отношении других серологических тестов, интерпретация результатов должна проводиться при обязательном сочетании с другими показателями и симптомами заболевания.

Результаты теста TPPA

Оценка результата происходит по системе «плюсов» - от (–) до (2+). Результаты теста видны невооруженным глазом и интерпретируются следующим образом:

Степень агглютинации	Показатель теста	Интерпретация
Агглютинированные частицы равномерно выстилают дно лунки планшета	2+	Положительный
Достоверное большое кольцо с неровными внешними полями и периферической агглютинацией	1+	Положительный
Частицы образуют компактное кольцо с просветом в центре и плавными гладкими внешними границами	±	Слабоположительный
Частицы формируют в центре лунки компактное кольцо с незначительным просветом в центре и ровной внешней границей	–	Отрицательный
Частицы формируют в центре лунки «пуговку» с ровной внешней границей	–	Отрицательный

Учет результатов производят, чтобы определить соответствие описанию выше. Образцы, показавшие неопределенный результат (±) необходимо исследовать повторно. В случае, если в нескольких тестах методом TPPA образец показывает неопределенный результат, рекомендуется провести исследование с помощью других методов.

Результаты анализа не следует рассматривать изолированно. Например, на ранней стадии инфекции число антител ещё слишком незначительно, вследствие чего TPPA и многим другим методам не хватает чувствительности. Поэтому, в случае подозрения на сифилис, даже если результаты тестов отрицательны, образцы необходимо исследовать ещё раз. Для постановки диагноза необходимо учитывать клинические симптомы, имеющиеся у пациента, клиническую историю и другие данные.

Так же, как и в реакции РПГА, для TPPA может наблюдаться феномен прозоны и ложноотрицательный результат в случае, если образец сыворотки содержит слишком высокий титр антител.

ИФА - Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА; The enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) является одним из многочисленных методов серологической диагностики инфекционных заболеваний. Иммуноферментный анализ (ИФА) в серодиагностике сифилиса - это тест на антитела классов M, G и A (IgM, IgG, IgA) против антигенов бледной трепонемы. Возможна постановка ИФА с ликвором.

Внедрение в практику иммуноферментного анализа (ИФА) вместо реакции Вассермана и других кардиолипиновых тестов значительно повысило качество лабораторной диагностики сифилиса. Существенным преимуществом данного метода является возможность автоматизации процесса исследования, что позволяет снизить влияние человеческого фактора.

1. История метода ИФА

Основные принципы иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя разработали E.Engvar и соавтор. (1971), B.Van Weeman и A.Schuurs (1971). Разработанный ими иммуноферментный анализ впервые был предложен для диагностики сифилиса в 1975 г. J. Veldkamp и A. Visser, которые оценили потенциал этого автоматизированного теста. ИФА начал повсеместно использоваться в диагностике сифилиса в 1980-е гг., когда были разработаны и сертифицированы диагностические тесты и стандартизированы методики тестирования. В СССР методику постановки ИФА для диагностики сифилиса разработали B.Н.Беднова, А.В.Бабий и А.В.Котровский (1982, 1983).

2. Принцип метода ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА) по механизму реакции близок к РИФ (выявляются те же антитела). Реакцию иммуноферментного исследования относят к иммунологическим реакциям, основанным на высокоспецифическом взаимодействии антигенов бледной трепонемы с антителами больного сифилисом.

В сифилидологической практике используется в основном непрямой вариант ИФА. Принцип наиболее часто используемого непрямого варианта реакции состоит в следующем. На поверхности лунок полистиролового планшета фиксируются иммунные комплексы, образующиеся при взаимодействии антител больного сифилисом с антигенами бледной трепонемы. После этого их выявляют их в цветной реакции с помощью специфических коньюгатов и соответствующих субстратно-хромогенных добавок.

Порядок выполнения теста следующий: на твердофазный носитель с присоединенным к нему антигеном помещается сыворотка больного. При наличии в ней антител, на поверхности носителя образуется комплекс антиген-антитело. Для «проявления» результатов реакции используются антивидовые антитела к Ig человека, конъюгированные с ферментными маркерами. В случае положительной реакции фермент, присоединившийся к комплексу антиген-антитело, разлагает добавленный в систему субстрат, в результате чего развивается цветное окрашивание разной интенсивности.

В реакции определения комплекса сорбированных на твердой фазе АГ и АТ проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом, по цветной реакции фермента с субстратом.

В реакции определение комплекса сорбированных на твердой фазе антигенов и антител проводят с помощью антиглобулиновых антител, меченных ферментом.

ИФА представляет возможность выявления сывороточных Ig разных классов. На рынке представлены системы, позволяющие определять раздельно IgM и IgG и суммарные антитела.

Специфические антигены, применяемые для ИФА, могут иметь различное происхождение:

ультраозвученные - их получают при результате разрушения бактериальной клетки T.pallidum ультразвуком или иным методом;

рекомбинантные - их получают генно-инженерными технологиями путем внедрения в геном бактериальной клетки (например, кишечной палочки E.Coli) гена, ответственного за синтез определенного антигена T.pallidum, с последующим наращиванием бактериальной массы продуцирующего микроорганизма, разрушением этих клеток, выделением и очисткой антигена;

пептидные - получают в результате последовательного химического синтеза антигенных эпитопов белков T.pallidum.

Организм способен образовать антитела почти к любой части молекулы антигена. При нормальном иммунном ответе этого обычно не происходит. Один или несколько иммуногенных пептидов, выделенных из белкового антигена обладают особой антигенностью, и большинство антител образуется именно к ним. На них развивается наиболее интенсивный иммунный ответ. Наибольшую информативность в ИФА показали иммунодоминантные участки белков бледной трепонемы с молекулярной массой 15 кД, 17кД и 47кД. В качестве антигена использовали детергентный экстракт, или соникат патогенных трепонем штамма Никольс.

3. Способ проведения исследований методом

Принцип метода заключается в выявлении сорбированного на твердой фазе (поверхность лунок пластикового планшета) специфического комплекса антиген-антитело антиглобулиновыми антителами, меченными ферментом (пероксидазой), с помощью цветной реакции с субстратом, учитываемой количественно спектрофотометрически.

Антигены, применяемые для сенсибилизации лунок полистиролового планшета могут быть:

• лизатными - полученными в результате разрушения ультразвуком бледной трепонемы;
• пептидными - полученными в результате химического синтеза фрагментов белков бледной трепонемы и имеющими антигенную реактивность, аналогичную исходным белкам возбудителя;
• рекомбинантными - полученными с помощью методов генной инженерии, несущими антигенные детерминанты, идентичные бледной трепонеме.

В сифилидологической практике обычно используется непрямой вариант ИФА.

4. Учет результатов

При ИФА для визуализации реакции антиген-антитело используют реакцию фермента (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) с субстратом, который при этом меняет свою окраску. Интенсивность окраски определяет позитивность реакции (от «–» до «++++»). Результаты ИФА могут оцениваться визуально по 4-бальной системе или инструментально в виде цифровых показателей оптической плотности, получаемых на специальных ридерах (типа Мультискан) при длине волны 492 нм. Т.к. оценка результатов проводится спектрофотометрически, это исключает субъективную интерпретацию.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Сроки позитивации ИФА - с 4-ей недели от заражения. Результаты ИФА (как и РИФ) становятся положительными в первые дни первичного периода или в конце инкубации и остаются положительными во всех периодах. ИФА особенно ценен в ранней диагностике сифилиса – положительные результаты выявления антител могут быть получены уже в конце инкубационного периода заболевания (т. е. на 4–6-й неделе после инфицирования).

6. Чувствительность и специфичность

ИФА – высокочувствительный и специфичный тест, что является его преимуществом. ИФА по механизму реакции, чувствительности и специфичности близок к РИФ, т.к. в обеих реакциях принимают участие одни и те же антитела. Большинство исследователей отмечают высокую специфичность и чувствительность на всех стадиях болезни. Чувствительность различных вариантов ИФА, по данным Г. А. Дмитриева, достигает 98–100 %, а специфичность - 96–100 %. По данным ЦНИКВИ, чувствительность ИФА при сифилисе составляет 99,1% (Приказ № 87 М3 РФ).

Вариант твердофазного ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) относится к самым чувствительным серологическим реакциям, позволяя выявлять 0,0005 мкг/мл антител и 0,000005 мкг/мл антигенов.

7. Область применения метода

Метод рекомендуется использовать при обследовании беременных, контактных лиц, доноров и представителей групп риска. ИФА может применяться как в качестве скринингового, так и подтверждающего теста. За относительно короткое время своей истории, ИФА превратился из ориентировочного теста в подтверждающий. В диагностике сифилиса тест используется также как подтверждающий для образцов, демонстрирующих положительные результаты при использовании различных нетрепонемных тестов и РПГА.

Метод ИФА может быть использован в количественном варианте с расчетом индекса позитивности, или реактивности, который позволяет оценивать уровень антител в образце.

В настоящее время в России применение иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса регламентировано Приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (приложение №1 «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис»). В приказе планируется замена РСК в комплексе серореакций (КСР) на ИФА и РПГА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Иммуноферментный анализ является сложным многоступенчатым исследованием, при котором необходимо строго соблюдать все рекомендации производителей диагностических наборов, правила регулировки и настройки применяемой в исследовании аппаратуры.

Источником ошибок при постановке ИФА могут являться следующие моменты:

Исследование в реакции гиперлипидемичной, гемолизированной сыворотки крови или образцов с признаками бактериального пророста;

Не практиковать двух- и более кратного замораживания образца биологического матери¬ала, при необходимости повторного исследования использовать сыворотку из пробирки-дубликата;

Нарушение сроков и условий хранения иммуносорбента и отмывающего раствора; использование тест-наборов с истекшим сроком годности;

Применение компонентов реакции из других диагностических наборов;

Нарушение времени проведения этапов реакции;

Высыхание лунок иммунологического планшета на этапах реакции;

Повторное использование пластиковой посуды (пластиковых лоточков) для приготовления смеси хромогена и субстрата;

Несоблюдение периодичности метрологического контроля параметров работы применяемых аппаратов (вошера и спектрофотометра);

Использование при постановке реакций загрязненной лабораторной посуды: колб, мерных цилиндров, пробирок, пипеток, наконечников пипеточных дозаторов;

Недостаточная тщательность выполнения разведений образцов биологического материала;

Ошибки при внесении образца биологического материала в соответствующую лунку планшета;

Ошибки при перенесении результатов исследования в журнал регистрации, протокол исследования или бланк ответа.

Тщательное выполнение рекомендаций инструкций по применению диагностических тест-наборов, регулярная поверка точности пипеточных дозаторов и автоматических приборов, применение внутреннего положительного и отрицательного контролей позволяют получать результаты ИФА-исследования с высокой воспроизводимостью.

9. Особенности, преимущества и недостатки

ИФА относится к современным, перспективным методам серодиагностики сифилиса ввиду его простоты, воспроизводимости, доступности. Определение антител методом ИФА является идеальным способом диагностики, подходящим для одновременного исследования большого числа образцов. Благодаря своим преимуществам, он завоевал популярность во всех странах.

Технология ИФА-исследования предусматривает соблюдение всех рекомендаций производителей коммерческих диагностических тест-наборов и тщательности выполнения процедуры исследования. Для проведения исследований в ИФА необходимо приобретение дополнительного специального оборудования. Методика постановки занимает более длительное время по сравнению с РМП, RPR и РПГА.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать большое количество образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, что позволяет архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Достоинства:

• Дает возможность дифференцированного и суммарного определения IgM и IgG антител к возбудителю сифилиса.
• высокая чувствительность и специфичность, приближающиеся к 100%,
• воспроизводимость
• возможности автоматизации

К преимуществам ИФА относят высокую специфичность (96-100%) и чувствительность (98-100%), отмечаемые большинством исследователей.

Наличие автоматизации ряда этапов или всего процесса в целом позволяет одновременно исследовать поток с большим количеством образцов биологического материала при высокой степени стандартизации исследования, минимизации субъективного элемента в оценке результатов, возможности хранения фиксированных протоколов исследования, позволяющих архивировать данные исследования и обращаться к ним повторно для ретроспективного анализа.

Существенными недостатками методик, выполняемых вручную, в т. ч. определения антител к антигенам T. pallidum методом ИФА, являются:

~ возможные ошибки персонала при проведении исследования (оплошность, небрежность, нарушение технологии);

~ невозможность полной стандартизации процесса исследования при ручном варианте постановки ИФА;

~ повышенный риск заражения персонала.

10. Модификации метода

Наряду с классическим непрямым ИФА известен и метод ловушечного ИФА . Он был предложен в 1989 г. O. E. Ijsselmudien и соавт. для выявления антител класса IgM к антигенам Tr. pallidum. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

На поверхности лунок планшета сорбированы очищенные антитела к иммуноглобулинам человека класса M, и после инкубации исследуемой сыворотки все IgM связываются с носителем. Наличие же среди связанных IgM специфичных для антигенов Tr. pallidum выявляется с помощью антигенов Tr. pallidum, конъюгированных с ферментом.

Этот метод позволяет выявлять антитела не только класса IgM, но и классов IgG, IgA. Для этого лунки планшетов сенсибилизируются аффинно очищенными антителами определенного класса против иммуноглобулинов человека. При этом из сыворотки вылавливаются антитела этого класса, а выявление трепонемоспецифических антител осуществляется путем их соединения с конъюгатом, представляющих соединение трепонемного антигена с ферментом.

Использование ловушечного варианта иммуноферментного анализа снижает риск ложноположительных реакций, опосредованных ревматоидным фактором крови, перекрестными реакциями между иммуноглобулинами классов М и G. При обследовании новорожденных в этом случае также исключаются ложноположительные результаты анализа, связанные с выявлением IgM, направленных против материнских антитрепонемных IgG.

В качестве вариантов ИФА за рубежом нашли широкое применение enzyme immune assay (EIA) и система ICE Syphilis . В последней в ячейках планшета сорбирована смесь антител к IgM и IgG, а также трех рекомбинантных белков T. pallidum. Положительные результаты тестируются в этой же тест-системе в двух повторах для выдачи окончательного результата.

В России был разработан ряд тест-систем для серодиагностики сифилиса методом ИФА с отечественными реагентами. Эти системы обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

Помимо вышеперечисленных, существуют также другие варианты ИФА, в том числе допускающие прямое выявление возбудителя в крови (прямой ИФА), дот-ИФА с постановкой реакции на полосках нитроцеллюлозы, ИФА с капиллярной кровью, а также иммуноблоттинг, или Western Blot, с одновременным выявлением АТ к различным компонентам возбудителя.

Современной улучшенной модификацией ИФА является иммуноблоттинг.

ИХА (иммунохемилюминесцентный анализ), ИХЛ (иммунохемилюминесценция)

С развитием лабораторной диагностики в условиях модернизации здравоохранения РФ в практику лабораторий вошла автоматизация лабораторных исследований, которая позволяет стандартизовать аналитические этапы исследований. Это способствует повышению качества диагностики. С внедрением автоматизации стали применяться новые высокотехнологичные методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, такие как иммунохемилюминесцентный анализ (ИХА) (chemiluminescence immunoassay - CLIA)

Хемилюминесценция - процесс излучения фотонов при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. В ходе реакции хемилюминесценции выделяется значительное количество энергии, и квантовый выход излучаемого света достаточно высок. Из всех неизотопных методов хемилюминесценция обеспечивает наиболее высокую чувствительность. Для иммунометрических методов чувствительность хемилюминесценции на порядки превосходит чувствительность радиоиммуноанализа.

Метод иммунохемилюминесценции (ИХЛ) в настоящее время нашел свое применение при диагностике маркеров опухолей, аутоиммунных заболеваний, диабета, кардиомаркеров, гормонов (щитовидной железы, надпочечников, женских и мужских половых гормонов), torch-инфекций, вирусных гепатитов, вирусов группы герпеса.

На основе метода иммунохемилюминесценции разработан ряд высокочувствительных и специфичных (98-100%) тест-систем для диагностики сифилиса, применяемых в основном за рубежом.

В методе в качестве антигенов используются полученные генно-инженерными методами рекомбинантные липопротеины, которые являются полными аналогами антигенов T.pallidum.

Метод ИХА по результатам клинического исследования получил признание и рекомендован к применению в лабораторной диагностике сифилиса в Российской Федерации в качестве скринингового и подтверждающего теста при наличии в лабораториях соответствующего оборудования. В 2012 г. ИХА был включен в качестве скринингового и подтверждающего теста для диагностики сифилиса в Клинические рекомендации по ведению больных с инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями

Таким образом, использование высокотехнологичного ИХА, вошедшего в практику как мировой, так и отечественной лабораторной диагностики с внедрением автоматизации, обеспечивает следующие преимущества:

• исключение влияния субъективных факторов на аналитическом этапе исследования
• безопасность персонала при выполнении исследований потенциально инфицированного биологического материала
• повышение скорости получения результатов пациентом
• стандартизацию исследований и контроль качества исследования
• выдачу надежных достоверных результатов пациентам
• высокое качество клинических лабораторных исследований.

По чувствительности метод ИХА сопоставим с методом радиоиммунного анализа, а по простоте исполнения, безопасности для персонала и многим другим параметрам – превосходит его.

Метод ИХА, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (98–100%), дает возможность количественного определения уровня антител к возбудителю сифилиса, может быть использован для подтверждения сифилитической инфекции и скрининга. Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат.

Иммунохроматография (ИХГ).

Относительно новыми для использования в Российской Федерации являются методы выявления трепонемоспецифических антител, основанные на методах иммунохроматографии (ИХГ). Как и в методе ИХА, в качестве антигенов используются рекомбинантные липопротеины, полученные генно-инженерными методами (например: антигены Tp15, Tp17, Tp47) и биосинтетический пептид TmрА. Перечисленные антигены также используются в разных сочетаниях в составе иммуносорбентов в ИФА и иммуноблоттинге.

Метод ИХГ позволяет быстро определять содержание трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяется при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям.

Ограничения применения: не может быть использован для контроля эффективности терапии,может давать ложноположительный результат.

ПБТ (простые быстрые тесты у постели больного)

Относительно недавно в серодиагностике сифилиса начало развиваться направление по разработке так называемых простых быстрых тестов (ПБТ), или тестов у постели больного (Point-of-care - РОС). Простые быстрые тесты у постели больного, или иммунохроматографические тесты позволяют проводить быстрое определение содержания трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяться при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям. Ограничения применения: не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, могут давать ложноположительный результат.

Эти тесты основаны на иммунохроматографическом определении антител к трепонемным антигенам бледной трепонемы я выполняются на стрипах; при этом можно использовать как цельную кровь, так и сыворотку (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Формат тестов позволяет проводить исследования при отсутствии специального оборудования и без использования электричества. Однако ввиду относительно невысокой чувствительности и специфичности эти тесты пока не находят своего широкого применения в практике.

Иммуноблотинг (Western Blot)

В последние годы появились методы исследования, направленные на обнаружение и анализ содержания антител к каждому антигену бледной трепонемы раздельно. Один из таких методов - это метод иммунного блота (или блоттинга, имммуноблотинга, Western blot), который применяют для определения IgG- либо IgM-антител к бледной трепонеме. Метод иммуноблоттинга является модификацией иммуноферментного анализа - вариантом ИФА.

Имммуноблотинг является одним из самых современных методов серодиагностики сифилиса и активно используется за рубежом. Свое название ("западный блоттинг") он получил в качестве юмористического ответа на названия техник определения ДНК ("южный блоттинг") и РНК ("северный блоттинг").

1. История метода

Иммуноблоттинг (Western blot) используют для определения IgG- либо IgM-антител к антигенам бледной трепонемы (Herremans М. et al., 2007).

2. Классический иммуноблот

Классический иммуноблот (Western Blot Analysis) сочетает в себе иммуноферментный анализ и применение электрофоретического метода. Белки-антигены возбудителя сифилиса предварительно разделяют методом электрофореза и переносят на носитель - нитроцеллюлозную мембрану (стрип). Этот перенос и называется блоттингом. Затем этот носитель с разделенными точками (blots), обрабатывают исследуемой сывороткой и антителами к IgG или IgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. Метод предполагает использование природных или рекомбинантных белков трепонемы.

Электрофорез - это разделение заряженных соединений на основе их подвижности в электрофоретическом поле. При наложении разности потенциалов в какой-то среде положительно заряженные молекулы движутся к отрицательно заряженному электроду, а отрицательно заряженные - к положительному электроду.

Большинство глобулярных белков собраны таким образом, что большая часть заряженных групп, а именно гидрофильных, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены во внутрь глобулы. В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду.

Электрофоретическое разделение белков производят в синтетический гелевой среде на основе полиакриламида. Для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой перед началом электрофореза белковую смесь преинкубируют в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Детальные исследования зарубежных ученых Weber и Osborn (1969) показали, что после такой обработки единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле (ПААГ) является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Это позволило применить метод электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН для достаточно точного определения молекулярной массы белков и пептидов. В зарубежной литературе этот метод был назван SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Профиль реактивности в классическом WB-тесте с природными антигенами (метод электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). (1) - контрольный положительный результат, (2) - контрольный отрицательный результат, (3-6) - клинические образцы.

В тестах на сифилис с помощью данного метода, предварительно очищенная и разрушенная до составных компонентов бледная трепонема подвергается электрофорезу в полиакриламидном или агарозном геле. При этом входящие в ее состав антигены разделяются по молекулярной массе.

Затем методом вертикального электрофореза антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый глазом спектр антигенных полос, характерный для бледной трепонемы.

При проведении анализа на нитроцеллюлозную полоску (стрип) наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и др.). Если в пробе есть специфические антитела, то в процессе инкубации они прочно связываются со строго соответствующими (комплементарными) им антигенными полосами и образуют комплекс “антиген – антитело”.

После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов во время отмывания стрипа следует инкубация с конъюгатом – меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (антитела к IgG или IgM человека), в ходе которой на поверхности мембраны происходит присоединение к имеющимся комплексам “антиген – антитело” антител, меченных ферментом.

После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция – окрашивание участков мембраны (в виде полос), где располагаются отдельные антигены бледной трепонемы, антитела к которым находились в исследуемой сыворотке. Интенсивность окрашивания зависит от количества связавшихся антител из сыворотки. Результат реакции оценивается визуально.

Наличие полос на определенных участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам бледной трепонемы.

Определяемые с помощью этого метода иммунодетерминанты 15, 5, 17, 44,5, 47 кД обладают диагностической значимостью при сифилисе. Ig G-иммуноблоттинг по чувствительности и специфичности подобен РИФ с абсорбцией (РИФ abs). Ig М-иммуноблоттинг может служить диагностическим тестом для врожденного сифилиса.

3. Иммуноблот в формате линейного иммунного анализа

Линейный иммунологический анализ (line immunoassay, LIA) позволяет одновременно определять антитела к антигенам бледной трепонемы в сыворотке или плазме крови человека. Антигены заранее нанесены на тест-полоски (стрипы), которые поставляются в составе коммерческих диагностических наборов.

Стрипы изготавливаются из нитроцеллюлозной мембраны, полиамидной с пластиковой подложкой или нейлоновой мембраны с пластиковой основой. При изготовлении, на тест-полоску помещают несколько дискретных антигенов в виде отдельных антигенных линий. Помимо этих антигенов сифилиса, на каждую полосу наносятся еще четыре контрольных линии: стрептавидин и контрольные пробы (3 + , 1 + и ± линия среза).

Для полосок используются искусственные антигены, полученные генно-инженерными способами - рекомбинантные белки или синтетические полипептидные конструкции. Это аналоги поверхностных антигенов бледной трепонемы - TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с молекулярной массой 15, 17, 47 kDа и 44,5 (ТmpА), где kDа=kiloDaltons. С их помощью определяют сывороточные антитела к различным иммунодоминантным компонентам возбудителя.

Инкубация испытательного образца проходит в кювете, куда также помещается индикаторная полоса. Антитела к T. рallidum определяются по связыванию с антигенами, нанесенными на тест-полоски. Если в образце имеются специфичные для T. pallidum антитела, они образуют связи с отдельными линиями антигенов. При взаимодействии антител, содержащихся в испытуемой сыворотке, с дискретными антигенами Т. pallidum, помещенными тест-полоску, образуется комплекс антиген-антитело в виде визуально определяемых цветных полос.

При учете результатов иммуноблотинга оценивают реактивность сыворотки к каждому из антигенов в отдельности. Суммарный положительный ответ выдается при получении результата одновременно с двумя или тремя из представленных антигенов.

Исследовательские процедуры проводятся вручную или на специальном анализаторе, с интерпретацией результатов с помощью специализированной компьютерной программы для инфекционных заболеваний.

За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса, метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

4. Учет результатов

Для считывания интенсивности окрашивания антигенных полос на стрипах разработаны фотометры, работа которых основана на отражении сигнала, что исключает субъективную оценку и дает потенциальную возможность автоматизации.

5. При каких периодах заболевания лучше использовать

Тесты, использующие метод иммуноблоттинга, могут определять специфические антитела к антигенам бледной трепонемы на очень ранней стадии заболевания. Наиболее значимыми в диагностике сифилиса являются антитела к антигенам бледной трепонемы TpN15, TpN17, TmpA и TpN47. Эти антигены - мембранные белки, имеющие молекулярную массу 15, 17, 44,5 и 47 кДа соответственно.

При внедрении в организм человека бледной трепонемы, противосифилитические антитела появляются в таком порядке: сначала развивается иммунный ответ к антигенам TpN17, затем к TpN47, после TpN15 и позже всех TmpA. При учете результатов теста оценивают реактивность сыворотки к каждому из них в отдельности. Например, когда в линейном блоте имеется реактивность только к антигенной линии TpN17 и TpN47, это означает, что болезнь в начальной стадии. Чем больше антигенных линий становятся реактивными, тем дальше развивается инфекция. При лечении сифилиса картина реактивности в этом тесте меняется.

Определение IgM к протеинам с молекулярной массой 15,17, 41, 47 кДа позволяют выявить 29,2% больных при вторичном сифилисе, 12,5% – при раннем скрытом сифилисе и 8,0% – при серорезистентности. Поиск IgG к тем же молекулам характеризуется чувствительностью 61,6% при серорезистентности и 100% при вторичном и раннем скрытом сифилисе.

6. Чувствительность и специфичность

Согласно данным литературы, чувствительность и специфичность теста очень высокие - 99,6-100 и 99,3-99,5 % соответственно. В классическом методе это достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичности детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях с помощью иммуноблоттинга можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме.

Чувствительность линейного блота также составляет 99.6%, а специфичность находится в диапазоне между 99.3% и 99.5%.

По оценке специалистов иммуноблоттинг с рекомбинантными высокоспецифичными антигенами по чувствительности и специфичности аналогичен РИФ-абс.

Согласно данным зарубежной литературы и результатам изучения в ЦНИКВИ, метод иммуноблоттинга обладает при диагностике сифилиса высокой чувствительностью (98,8-100%) и специфичностью (97,1-100%).

7. Область применения метода

Иммуноблотинг (иммуноблот) является высокоспецифичным и высокочувствительным референтным методом. Высокие чувствительность и специфичность позволяют рассматривать этот метод как подтверждающий тест на сифилис. Метод может применяться для подтверждения диагноза, а также в случае, если другие трепонемные тесты дают сомнительные и противоречивые результаты. С помощью иммуноблоттинга можно подтвердить диагноз у пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в том числе и при помощи РПГА или ИФА.

8. Источники и причины ошибок при постановке, ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Ложноположительные результаты очень редки. Ложноотрицательные результаты бывают также достаточно редко и наблюдаются у больных с иммунодефицитами – чаще у ВИЧ- инфицированных и при эффекте диагностического «окна» из-за задержки синтеза антител, а также при ошибках на этапе постановки.

Использование современных тест-систем диктует точное соблюдение всех требований, предъявляемых как к материалу, так и к выполнению постановки реакции. В основном, источник ошибок - нарушение порядка и технологии проведения исследования (особенно для классического вестерн-блота), несоблюдение рекомендаций производителей тест-наборов. . Ошибки могут быть также допущены при сборе, доставке, хранении проб сыворотки крови, а также при выполнении тестов. Помимо испорченных образцов, среди других возможных причин - использование тест-наборов с истекшим сроком годности, а также ошибки при анализе результатов исследования.

9. Особенности, преимущества и недостатки

Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности результатов.

Тест не требует высокоочищенных антигенов, референтных и контрольных сывороток. Идентификация мишени антител основана на молекулярном весе белка, с которым реагируют антитела из сыворотки пациента. В одной реакции может быть обнаружено связывание антител с несколькими антигенами, каждый из которых может быть точно охарактеризован. За счет этого иммуноблоттинг обладает рядом преимуществ перед другими методами выявления антител, результаты которых зависят от стандартизации, чувствительности, качества субстрата, нестабильности или нерастворимости определенных антигенов

Метод легко воспроизводим, относительно прост в исполнении и интерпретации результатов, дает возможность определять спектр антител сразу к нескольким антигенам Т. pallidum и оценивать вклад в общую реакцию антител различной специфичности.

Применение высокоочищенных рекомбинантных и пептидных антигенов снижает до минимума неспецифическую реактивность сывороток. Использование метода дает возможность отказа от трудоемких и субъективных методов, представляющих опасность для исследователя (перевивка штаммов Г. pallidum, работа с патогенной Т. pallidum при постановке реакции). Это определяет предпочтение метода иммуноблоттинга перед другими трепонемными тестами (РИФ и в особенности РИБТ) для диагностики сифилиса.

10. Модификации метода

Существует несколько коммерческих тест-систем на основе данного метода. Одни из них выполнены в формате вестерн-блота , состоят из стрипов, на которые перенесены белковые компоненты T. pallidum, предварительно разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле.

Другие выполнены в формате линейного блота , состоят из стрипов, на которых в виде дискретных линий сорбированы рекомбинантные и синтетические полипептиды - аналоги поверхностных антигенов T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

Результаты вестерн-блота труднее интерпретировать, так как на стрипах выявляется большое разнообразие антител, многие из которых являются группоспецифическими. Напротив, интерпретация результатов линейного блота не вызывает затруднений; кроме того, дополнительные контрольные линии, нанесенные на стрип, позволяют проводить полуколичественную оценку уровня антител к четырем антигенам T. pallidum.

xMAP-технология

хМАР - современная технология, позволяющая проводить многопараметрические исследования путем одновременной детекции множества аналитов в одном биологическом образце. В качестве твердой фазы используются окрашенные микросферы, покрытые захватывающими реагентами (олигонуклеотидами, антителами, антигенами).

Исследуемый образец добавляется к раствору, в котором содержатся микросферы. Выявляемые в образце аналиты связываются с соответствующей микросферой, после чего в раствор вносится детектирующий агент (детектирующие антитела, флюоресцентная метка). Для детекции определяемого аналита используется система двух лазеров, позволяющих проводить как качественную оценку наличия аналита в пробе (для этого используется красный лазер, классифицирующий микросферы по цвету), так и количественную оценку содержания аналита в пробе (для этого используется зеленый лазер).

Исследование осуществляется в автоматическом режиме на анализаторах типа Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) снабженных программным обеспечением.

Ппроизводительность xMAP-технологии значительно превышает показатели классического твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) при существенно меньшем объеме биоматериала.

хМАР-технология, обладающая высокой аналитической чувствительностью, в настоящее время используется для решения широкого круга клинических задач. С ее помощью в одном образце биологического материала осуществляется одновременная детекция известных онкомаркеров, кардиомаркеров, маркеров острой фазы и сахарного диабета, широкого спектра цитокинов, хемокинов, факторов роста. Одномоментное выявление множества аналитов в одном биологическом образце позволяет существенно сократить время обследования пациента. К настоящему времени разработан ряд тест-систем для выявления антител к возбудителям ИППП, в частности сифилитической инфекции, методом хМАР.

МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР "На Самотечной"

Прием по предварительной записи! Суббота, воскресенье.

Определяет антилипидные антитела (реагины). К сыворотке крови пациента добавляют сифилитические антигены, образующие с реагинами иммунный комплекс , способный адсорбировать и связывать комплемент. Если такой комплекс образуется, то разрушение эритроцитов (гемолиз) не происходит, и они выпадают в осадок (положительная реакция). Если в сыворотке пациента нет реагинов, то происходит гемолиз, и эритроциты в осадок не выпадают (отрицательная реакция).

RPR (Rapid Plasma Reagin)

Или реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном – это скрининговый метод диагностики сифилиса. Данная реакция в определенной степени может рассматриваться как более современная модификация реакции Вассермана. Основным показанием к проведению этого теста является первичное обследование на сифилис, медицинские осмотры , контроль эффективности лечения. Положительный результат требует проведения других, более точных тестов для подтверждения диагноза.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Один из самых перспективных методов лабораторной диагностики сифилиса. Его принцип - выявление специфического комплекса антиген-антитело, который образуется при соединении сифилитических антигенов, абсорбированных на твердом носителе, с антителами исследуемой сыворотки крови. В настоящее время наиболее распространенным является непрямой вариант ИФА, на заключительном этапе которого используются антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с пероксидазой хрена или другими ферментными маркерами. Измеряется окрашивание конечных продуктов этой реакции, которая зависит от количества связанных антител сыворотки.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В ходе реакции иммунофлюоресценции (РИФ) определяется интенсивность свечения бледных трепонем в препарате, которая возникает только в присутствии антитрепонемных антител в сыворотке крови. Реакция проводится с сывороткой в разном разведении (в 10 и 200 раз).

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Наиболее специфичный диагностический тест на сифилис. В сыворотке крови больных производится определение видеоспецифичных антител (иммобилизинов), которые обездвиживают бледные трепонемы в присутствии комплемента. С помощью микроскопа проводится подсчет доли утративших подвижность (иммобилизованных) бледных трепонем. Кровь методом РИБТ исследуют не ранее чем через 2 недели после окончания приема антибиотиков и других лекарственных средств.

Исследование крови методами РИБТ и РИФ выполняют для диагностики скрытого сифилиса. РИФ (10-ти кратное разведение сыворотки) позволяет поставить диагноз даже у тех пациентов, в исследованиях которых бледная трепонема не обнаруживается.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Соединение бледных трепонем сыворотки крови с обработанными специальными методами бараньими эритроцитами. При наличии в сыворотке крови возбудителя сифилиса происходит агглютинация (склеивание и последующее осаждение) эритроцитов. Реагенты вносят в лунки специальных пластин, о результате реакции судят по окрашиванию. Агглютинат эритроцитов имеет темно-красный цвет и форму пятна или кольца.

В сети клиник «МедЦентрСервис» Вы можете сдать кровь на сифилис любым из вышеописанных методов. Кровь на анализ нужно сдавать из вены, натощак (не менее 4 часов с последнего приема пищи). Не рекомендуется сдавать кровь после приема алкоголя, лекарственных препаратов , а также во время менструального цикла.
Если у Вас есть подозрение, что Вы могли заразиться сифилисом или Вы планируете беременность, то не откладывайте сдачу анализов, приходите в клиники «МедЦентрСервис» .

РИФ, РИБТ, РПГА

РИФ - реакция иммунофлюоресценции - трепонемный тест. Является одним из самых чувствительных анализов на сифилис. РИФ становится положительной через 10-20 дней после инфицирования, что относит ее к методам раннего выявления сифилиса.

Показания проведения РИФ:

• Постановка РИФ проводится у лиц с симптомами сифилиса, при этом отрицательными реакциями - РМП, РВ;
• в качестве дифференциальной реакции у лиц с положительными реакциями RW, микрореакции и отсутствием симптомов;
• у беременных при отсутствии клинических проявлений и сифилиса в анамнезе.

Методика проведения РИФ:

• При проведении реакции в сыворотку пациента добавляется кровь кролика, зараженная бледной трепонемой(возбудитель сифилиса) и флюоресцирующая(светящаяся) сыворотка. Исследование заключается в наблюдении свечения комплексов под люминесцентным микроскопом. Результаты реакции интерпретируются в зависимости от интенсивности свечения от 1+ до 4+, что указывает на наличие сифилиса. Отсутствие свечения - отрицательный результат РИФ обозначает, что обследуемый здоров. Ложные результаты анализа встречаются крайне редко при системных процессах , беременности и т.д.
• Реакция ставится в модификации РИФ-200 и РИФ-авс(абсорбция).
• Чувствительность реакции при первичном сифилисе составляет порядка 85%
• при третичном сифилисе - 98-100% .

Негативация РИФ происходит в течение нескольких лет после лечения сифилиса. После проведенной противосифилитической терапии необходимо наблюдение за показателями в динамике.

РИБТ - реакция иммобилизации бледных трепонем - является самым специфичным анализом крови на сифилис. РИБТ высококачественный, дорогостоящий анализ крови, выполнение которого могут позволить себе хорошо оснащенные лабораторные комплексы. РИБТ является основополагающей реакцией при скрытых формах сифилиса, нейросифилисе, висцеросифилисе. Позволяет отдифференцировать ложноположительные реакции от истинного заболевания сифилисом.

Постановка реакции основана на обездвиживании (иммобилизации) возбудителя сифилиса видоспецифичными антителами. Путем микроскопического исследования читается результат реакции: 0-20% - отрицательная, 21-30%- сомнительная, 31-50% - слабоположительная, 51-100% - положительная реакция. То есть к положительным результатам на сифилис относятся те, где РИБТ более 50%. При сифилисе РИБТ становится положительной достаточно медленно: в первичный периоде сифилиса она еще отрицательна, во вторичном свежем периоде - положительна в 50% случаев, во вторичном рецидивном периоде - положительна в 90-100%, в третичном периоде - положительна в 99-100%.

Негативация РИБТ осуществляется десятилетиями, поэтому как критерий достоверности излеченности ее использовать неправомочно, тем не менее динамическое наблюдение после проведенного противосифилитического лечения необходимо.

Проведение реакции РИБТ целесообразно не ранее чем через 30 дней после окончания лечения. РПГА - реакция пассивной гемагглютинации - относится к трепонемным тестам, проводится в комплексе с нетрепонемными. Используется для подтверждения диагноза сифилиса на любой его стадии.

Реакцию целесообразно проводить через 4 недели после предполагаемого заражения. При проведении реакции к сыворотке крови пациента добавляют препарат, приготовленный из эритроцитов животного происхождения, сенсибилизированных антигеном бледной трепонемы - возбудителя сифилиса.

Суть реакции РПГА заключается в склеивании (агглютинации) в присутствии антител к трепонеме и образовании агглютината - фигуры, которую наблюдает врач - лаборант. Реакция оценивается по количеству +: 4+- резкоположительный результат, 3+-положительный, 2+-слабоположительный, 1+-сомнительный, - - отрицательный результат. При положительном результате реакции проводится количественная оценка с определением концентрации (титра) антител. При прогрессировании сифилиса - титр антител постоянно растет.

РПГА остается положительной в течение десятилетий после лечения сифилиса, поэтому не может использоваться в качестве критерия достоверности излеченности. Однако необходимо наблюдать титр антител РПГА в динамике.

Метод обладает высокой чувствительностью . Результаты РПГА могут быть ложноположительны. К таким результатам анализа могут приводить болезни соединительной ткани , некоторые инфекции, и т.д.

Лабораторные исследования плазмы крови были и остаются главным способом диагностики и мониторинга сифилиса.

Этой болезни непостоянны, а скрытые формы вообще внешне не видны. Среди всего многообразия серологических методик, самые достоверные результаты предоставляет анализ на сифилис РИФ.

РИФ – это реакция иммунофлюоресценции. По диагностическим возможностям эта методика относится к непрямым специфическим тестам. То есть сам возбудитель обнаружить с ее помощью не выйдет. Но по косвенным признакам можно сделать обоснованное заключение о наличии или отсутствии бледной трепонемы в организме.

Для исследования требуются:

• Образец крови пациента. Как правило, используется венозная, однако имеются варианты проведения РИФ с капиллярной кровью из пальца.
• Типовой, промышленного изготовления, трепонемный антиген. Это особые белки спирохеты, которые служат «якорями» для антител к бледной трепонеме из сыворотки больного.
• Стандартная с белками-иммуноглобулинами, которые связываются с антителами крови пациента.
• Люминесцентный микроскоп.

Эта реакция обладает очень высокой специфичностью и чувствительностью. Но обходится недешево и ставится не так уж и легко. Поэтому в основном используется для верификации диагноза в сомнительных и ложноположительных случаях.

Как проводится РИФ-диагностика сифилиса?

Алгоритм постановки реакции иммунофлюоресценции состоит из нескольких шагов. В немалой степени из-за сложности проведения этой методики, она не подходит для массовых скрининговых исследований.

Сами шаги такие:

• Полученным от пациента образцом крови/плазмы, обрабатывают предметное стекло, на котором находится высушенный трепонемный антиген. Его получают из тканей яичка кролика, зараженного спирохетой штамма Никольса.
• Выдержав несколько минут, стекло промывают дистиллированной водой.
• Промытый образец обрабатывают специальной сывороткой промышленного изготовления, которая содержит в себе собственные антитела к человеческим противотрепонемным антителам. Иммуноглобулины этой сыворотки заранее помечены специальным веществом, которое под ультрафиолетом светится желто-зеленым цветом.
• Затем снова следует промывка.
• Предметное стекло помещается в люминесцентный микроскоп и изучается.

Если лаборант наблюдает в окуляре микроскопа характерное свечение, значит, антитела к бледной трепонеме в крови пациента были. Они связались с типовым антигеном. А на них, в свою очередь, прореагировали меченные люминофором иммуноглобулины из стандартизированной промышленной сыворотки.

Анализ на сифилис РИФ: достоверность результатов

В серологической диагностике сифилиса, очень важно получить достоверный и точный результат.

Чтобы повысить качество данных, предпринимаются определенные действия:

• Исследуемая сыворотка разводится в 200 раз (1:200), чтоб избежать ложноположительных реакций. Тогда говорят, что проводится анализ на сифилис РИФ 200 .
• В другом варианте, при разведении сыворотки 1:5, дополнительно используется специальный абсорбент, который собирает на себе «лишние» антитела, чтоб они не искажали результаты.

На руку исследователям играют и размеры трепонем. Крупные микробные тела спирохет хорошо заметны при люминесцентной микроскопии. Если на них «прицепляются» меченные люминофором белки из сыворотки. Использование стандартизированного антигена и сывороток, позволяет до максимума повысить чувствительность и специфичность РИФ в диагностике сифилиса.

Частные варианты анализов РИФ: РИФ абсорбция

Один из альтернативных способов называется РИФ-Абс. От обычной методики он отличается низким разведением исследуемой сыворотки – 1:5 против 1:200, как обычно.

В концентрированном образце содержится очень много активных белковых молекул.

Чтоб избежать и повысить чувствительность, сыворотку обрабатывают специальным абсорбентом из фрагментов сифилитических спирохет. Сорбент собирает на себе излишне активные антитела и потом уже образец обрабатывают промышленной, меченной люминофором сывороткой. Благодаря такой предварительной подготовке , отсеиваются все лишние молекулы, которые могли бы повлиять на результаты теста.

Ставят ее по таким показаниям:

• Положительная на фоне клинического благополучия и отсутствии рисков заражения в анамнезе.
• Позитивная РВ у больных, страдающих хроническими заболеваниями.
• Отрицательная РВ при появлении подозрительных в отношении сифилиса симптомов.

Первые позитивные результаты появляются уже на 15-16 день с момента инфицирования. Если реакция из положительной становится отрицательной, это сигнализирует о полном излечении от сифилиса. Вероятность ложноположительного результата составляет меньше 0,4%.

Такая ситуация может произойти при обследовании онкобольных, алкоголиков, беременных женщин и страдающих расстройствами иммунитета людей.

Определенная доля приходится и на технические ошибки, так как постановка достаточно сложная. Бывают случаи, когда необходимо отличить врожденную патологию от приобретенной. Сделать это можно, если поискать разные виды антител в крови пациента.

Антитела к сифилису класса M (IgM), появляются вскоре после заражения и по времени намного опережают IgG. Выявить их позволяет анализ на сифилис РИФ абсорбции IgM. Если результаты постановки этой реакции будут положительными, то можно говорить о недавнем заражении. Так случаи реинфекции можно отличить от рецидива или выявить заражение ребенка после родов.

По итогам такой методики анализов РИФ, также делают вывод об эффективности лечения раннего сифилиса.

При подозрении на сифилис обращайтесь к опытному венерологу.

Главная » Анализы » Что такое титры при сифилисе. Анализ на сифилис риф

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Обязательным условием является исключение перед обследованием приема больным антибиотиков, которые оказывают токсическое действие на бледные трепонемы, вызывая их неспецифическое обездвижение.

Положительные результаты РИБТ обнаруживаются примерно с середины вторичного свежего периода сифилиса, и могут длительно сохраняться после проведенного лечения. При необходимости метод используют для выявления АТ в СМЖ, это исследование отличает высокая специфичность, но низкая чувствительность (около 40 %).

РИБТ мало пригодна для диагностики ранних форм сифилиса ввиду позднего (не ранее 8–9 недель от момента заражения) появления АТ-иммобилизинов; метод может давать ложноположительные результаты, в особенности у больных с аутоиммунной патологией, злокачественными заболеваниями, диабетом. Кроме того, РИБТ – достаточно сложный, трудоемкий и дорогостоящий анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария, в связи с чем в последние годы он используется лишь в отдельных лабораториях. В диагностике РИБТ применяется как реакция-арбитр при расхождении результатов других серологических исследований, для дифференцирования ложноположительных результатов и при установлении диагноза поздних форм сифилиса.

Реакция связывания комплемента с трепонемным антигеном (РСК с ТА) .Чувствительность метода – около 80 %, специфичность – 98 %. Метод входил в состав комплекса стандартных серологических реакций на сифилис, регламентированного приказом Минздрава СССР № 1161 от 02.09.1985 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса». В настоящее время использование этой реакции, как и РСК с кардиолипиновым антигеном, ограничено отдельными лабораториями.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) . Для диагностики сифилиса используют несколько модификаций РИФ: РИФ-ц – для выявления АТ в СМЖ, РИФ-200 (тестируемую сыворотку перед реакцией разводят в 200 раз); РИФ-абс (РИФ с абсорбцией), IgM-РИФ-абс (для определения АТ IgM). По чувствительности и специфичности РИФ-абс не уступает РИБТ, но выполнение этого метода намного проще. Результаты РИФ-абс становятся положительными с 3–й недели после заражения (до появления твердого шанкра или одновременно с ним), это метод ранней диагностики сифилиса. Нередки положительные результаты исследования спустя много лет после полноценного лечения раннего сифилиса, а у больных с поздним сифилисом – на протяжении десятилетий.

Показания для выполнения РИФ-абс:

• положительные результаты НТТ у беременных при отсутствии клинических и анамнестических данных, свидетельствующих о сифилисе;
• обследование лиц с различными соматическими и инфекционными заболеваниями, при которых отмечают положительные результаты НТТ;
• обследование лиц с клиническими проявлениями, характерными для сифилиса, но с отрицательными результатами НТТ;
• ранняя диагностика сифилиса;
• в части случаев – как критерий успешности противосифилитического лечения: переход положительной РИФ-абс в отрицательную после лечения является 100% критерием излеченности сифилиса.

IgM–РИФ–абс применяют для раздельного выявления АТ классов Ig, что представляет особый интерес при диагностике врожденного сифилиса, когда АТ к трепонеме, синтезированные в организме ребенка, представлены IgM, а АТ IgG имеют материнское происхождение. Показаниями к проведению этого исследования являются: диагностика врожденного сифилиса; оценка результатов лечения раннего сифилиса.

РИФ обладает высокой чувствительностью (98,5%) и специфичностью (99,6%) практически при всех формах сифилиса. Недостатками РИФ являются: невозможность автоматизации исследования и учета результатов; трудности приготовления качественного антигена из взвеси бледных трепонем, полученных из яичка зараженного кролика; субъективизм в оценке результатов.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) . Сопоставление результатов, полученных при использовании РПГА и РИБТ, РИФ–абс, КСР, МРП показало высокую чувствительность и специфичность РПГА при диагностике сифилиса, совпадающую с результатами РИФ–абс.

РПГА может быть выполнена в качественном и количественном вариантах, существуют их макро- и микромодификации. Количественный метод РПГА позволяет оценить концентрацию специфических трепонемных АТ в крови. Титры от 1: 640 и ниже характерны для пациентов, леченных по поводу сифилиса в прошлом. Более высокие титры – обычно для активной нелеченной инфекции.

Положительные результаты РПГА, как правило, отмечают спустя 3 недели после появления твердого шанкра и далее у пациентов, перенесших сифилис, в течение многих лет, нередко пожизненно.

Чувствительность РПГА составляет 76% при первичном сифилисе; 100% при вторичном сифилисе; 97% при скрытом сифилисе; 94% при позднем сифилисе. Специфичность РПГА выше, чем специфичность РИФ–абс, составляет 99%.

Благодаря соотношению высокой специфичности, чувствительности, простоты выполнения, стандартизации реагентов среди трепонемных тестов для серодиагностики сифилиса РПГА стабильно занимает лидирующее место в клинической практике в мире.

Особые преимущества ИФА заключаются: в высокой чувствительности и специфичности метода; автоматизации постановки реакции; высокой степени стандартизации; возможности исследования большого количества образцов сывороток; в количественном учете и объективной документации полученных результатов; возможности одновременного определения титра противотрепонемных АТ разных классов (IgG и IgM) в одном образце; пригодности для ранней диагностики сифилиса и диагностики врожденного сифилиса; в удобстве применения для тестирования крови в службе переливания крови; применимости в качестве подтверждающего специфического трепонемного теста. Чувствительность ИФА 98–100%, специфичность 96–100%.

К недостаткам ИФА можно отнести: непригодность для исследования единичных образцов; более длительный срок до получения результата, и меньший срок годности ИФА-наборов, например, по сравнению с РПГА.

Иммунный блот (ИБ). Одним из современных методов диагностики сифилиса является ИБ для определения АТ IgG либо IgM к определенным АГ бледной трепонемы.

Метод обладает высокой чувствительностью (до 100%,), специфичностью (98%) и воспроизводимостью (100%). Исследование дает возможность изучения спектра АТ сразу к нескольким АГ T.pallidum, применения высокоочищенных рекомбинантных и пептидных АГ, снижающих до минимума неспецифическую реактивность сывороток.

Все это определяет возможность предпочтения применения метода ИБ перед другими трепонемными тестами для верификации диагноза сифилиса в сложных случаях, в частности, для диагностики сифилиса во второй половине инкубационного периода, скрытого врожденного сифилиса в первые дни жизни ребенка, для выявления скрытого сифилиса у лиц со слабым гуморальным ответом, а также для дифференцирования ложноположительных результатов других тестов.

Анализ на сифилис делают, применяя множество методик обнаружения возбудителя. При развитии патологии проявляется большое количество специфических признаков, поэтому с целью установления точного диагноза больного человека обследуют комплексно. Общий анализ крови при этом малоинформативен, его не используют при диагностировании данной венерической инфекции.

Виды исследований и биоматериалов для анализа

Для выявления болезни используют различные методики и биоматериалы. На ранних этапах сифилис определяют с помощью бактериоскопического теста. Образцы исследуют под микроскопом. Прибор позволяет обнаружить штаммы возбудителя. Позднее проводят серологические анализы крови. Благодаря им, в пробах выявляют антигены и антитела сифилиса.

Способы определения половой инфекции поделены на 2 категории:

• Прямые, выявляющие патогенный микроорганизм. К ним относят: темнопольная микроскопия, RIT-анализ (инфицирование кроликов биоматериалом для исследования), метод ПЦР – полимеразной цепной реакции (с его помощью находят генетические элементы возбудителя).
• Непрямые (серологические) позволяют обнаружить антитела к патогену. Они продуцируются иммунной системой, как ответная реакция на заражение.

Серологические методики поделены на 2 категории: трепонемные и нетрепонемные.

• Нетрепонемные, включающие: тест с толуидиновым красным, анализ РСК, RPR- тест, исследование крови экспресс-методом РМП.
• Трепонемные, включающие: иммуноблоттинг, РСК-тест, РИТ-анализ, исследование РИФ, РПГА-тест, ИФА-анализ.

Информативность тестов на инфекцию различна. Чаще делают основные виды анализов на сифилис, к которым отнесены серологические методики.

Биоматериал для исследования

Чтобы выявить бледную трепонему – патогена, который выглядит, как спираль и вызывает сифилис, берут пробы:

• венозной крови;
• ликвора (секрета из спинномозгового канала);
• содержимое лимфатических узлов;
• ткани изъязвлений.

Если необходимо провести тесты на обнаружение сифилиса, кровь сдают не только из локтевой вены, но и из пальца. На выбор биоматериала и способ исследования влияет тяжесть течения инфекции и оснащенность диагностического центра.

Прямые исследования

Убедительным доказательством сифилиса является выявление возбудителей инфекции под микроскопом. Таким способом находят патоген у 8 обследуемых из 10. Отрицательный результат у 2 оставшихся пациентов не говорит о том, что они не инфицированы.

Исследование делают на первичном и вторичном этапе (стадии) заболевания, для которых характерно появление высыпаний на коже и сифилом (изъязвлений) на эпителиальных тканях или слизистых оболочках. В отделяемом из очагов поражения находят патогены, вызывающие венерическое заболевание.

Точнее с определением трепонем справляется сложный тест, обозначающийся как РИФ – реакция иммунофлуоресценции. Образец для исследования предварительно обрабатывают флуоресцентными антителами. Соединения, способные светиться, склеиваются с бактериями. Рассматривая под микроскопом образцы, в случае заражения лаборант видит сверкающих возбудителей.

Тест используют для раннего диагностирования болезни. Чем дольше длится заболевание, тем ниже чувствительность исследовательских способов. Кроме того, она падает после обрабатывания высыпаний и язв антисептическими средствами и у пациентов, прошедших лечение. Изредка исследование дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты.

RIT-анализ – высокоточный способ обнаружения сифилиса. При проведении теста результаты приходится ждать долго. До тех пор, пока у инфицированного кролика не проявятся признаки инфекции. Тест применяют очень редко, несмотря на то, что он сверхточен.

С помощью полимеразной цепной реакции на сифилис определяют генетические элементы патогенов. Единственный недостаток ПЦР – дороговизна.

Нетрепонемные тесты

Такие анализы крови помогают выявить антитела, появляющиеся в ответ на кардиолипин – соединение, относящееся к общему строению мембран патогенов.

Реакция Вассермана (РВ или RW)

Самым известным исследованием на сифилис считается реакция Вассермана. РВ входит в категорию реакций связывания комплемента (РСК). Новые методы РСК обладают существенными отличиями от традиционной RW. Но обозначаются они, как и раньше понятием «реакция Вассермана».

Иммунная система, синтезирует антитела (маркеры) в ответ на вторжение трепонем. Их выявляют при анализе крови на сифилис методом реакции Вассермана. Положительный результат RW подтверждает инфицирование обследуемого.

Реакция гемолиза – индекс РВ анализа. При ней взаимодействуют 2 субстанции: гемолитическая сыворотка и эритроциты барана. Сыворотку делают, иммунизируя кролика эритроцитами барана. Активность биологической жидкости снижают путем прогревания.

Показатели РВ зависят от того, прошел гемолиз или нет. В пробе чистой от маркеров происходит гемолиз. При этом реакция на антигены невозможна. Комплемент тратится на взаимодействие с бараньими эритроцитами. Когда в образце есть маркеры, комплимент вступает в реакцию с антигенами. В этом случает гемолиз не протекает.